cas9蛋白切割位點位於哪裡

㈠ 胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，彈性蛋白酶，各自作用於蛋白水解的位點是什麼為什麼

胰蛋白酶在精氨酸和脯氨酸之後切割，胰凝乳蛋白酶在芳香族氨基酸位點後切割，彈性蛋白酶還不知道。

㈡ EK酶為什麼切到Arg位點了啊

腸激酶是一種特抄異性蛋白酶，其識別序列為天冬氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸－賴氨酸，切割位點位於賴氨酸之後。有時因蛋白質底物構象的變化，腸激酶可能在其他鹼性氨基酸殘基處發生切割。
你的蛋白是不是復性過，可能是復性不正確導致構象改變，從而酶切位點異常。

㈢ 如何用IEDB預測蛋白激酶的剪切位點，比如預測CⅡ蛋白質的蛋白激酶剪切位點

構成SP及CAA的主要成分是由APP剪切而來的分子質量約為4ku的多肽，因其呈β蛋白激酶C（PKC）〔19〕激活時可以使APPs的釋放增加，βA的生成減少．但

㈣ crispr/cas9的原理

此系統的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通過鹼基配對與 tracrRNA （trans-activating RNA ）結合形成 tracrRNA/crRNA 復合物，此復合物引導核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點剪切雙鏈 DNA。而通過人工設計這兩種 RNA，可以改造形成具有引導作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引導 Cas9 對 DNA 的定點切割。
作為一種 RNA 導向的 dsDNA 結合蛋白，Cas9 效應物核酸酶是已知的第一個統一因子（unifying factor），能夠共定位 RNA、DNA 和蛋白，從而擁有巨大的改造潛力。將蛋白與無核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，並表達適當的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可連接到目標DNA，不影響 Cas9 的結合。因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列處帶來任何融合蛋白及 RNA，這為生物體的研究和改造帶來巨大潛力。

㈤ 植物的遺傳密碼可不可以修改

植物的遺傳密碼是可以修改的。

「基因敲除」就是植物密碼修改的技術之一，它是指將一定的基回因答從基因組中刪除。在植物中，敲除某個基因後會產生外表形狀的變化，通過表型可以分析某個基因與某種性狀或功能是否有關系。同時，基因敲除也為定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技術支持。

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基因敲除原理

gRNA識別並結合在目標基因區域引導Cas9蛋白對結合位點進行切割，引起DNA雙鏈斷裂（DSB），觸發細胞自身的非同源末端修復機制（NHEJ），NHEJ修復的過程中往往會產生DNA的插入或刪除（Indel），造成移碼突變，致使基因功能喪失，從而實現基因敲除。

㈥ crispr基因點突變是怎麼做

十年前，當研究人員開始解析細菌和古細菌中一個稱為 CRISPR 結構的時候，他們並沒有預料到這會給基因編輯世界帶來一場風暴。在過去的這一年半時間里，CRISPR 方法已迅速席捲了整個動物王國，成為 DNA 突變和編輯的一種「馬上」技術——迄今為止在幾乎每種實驗細胞類型中都能起作用，包括人類細胞，小鼠，斑馬魚和果蠅細胞；這種技術也易於操作，已經有兩個研究組利用 CRISPR 分析了人類細胞中幾乎每個基因單突變（詳細報道 Science：CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：張峰建立CRISPR/Cas9人細胞敲除體系）。就在最近，CRISPR 還幫助研究人員完成了攜帶特殊基因中斷（gene disruptions）的工程猴，這項壯舉此前曾在小鼠中實現過，但未在靈長類動物中完成過（詳細報道 Cell：中國科學家利用CRISPR/Cas9技術構建基因工程猴）。

CRISPR 本身是一種防禦系統，用以保護細菌和古細菌細胞不受病毒的侵害。在這些生物基因組中的 CRISPR 位點能表達與入侵病毒基因組序列相匹配的小分子 RNA。當微生物感染了這些病毒中的一種，CRISPR RNA 就能通過互補序列結合病毒基因組，並表達 CRISPR 相關酶，也就是 Cas，這些酶都是核酸酶，能切割病毒 DNA，阻止病毒完成其功能。

將 CRISPR/Cas 系統用於其它非細菌細胞需要滿足兩個條件：一個 Cas 酶，用於切斷靶標 DNA，比如目的基因中的 DNA 片段，另外一個就是稱為導向 RNA （gRNA）的 RNA 分子，這種分子能通過互補結合靶標。gRNA 也就是細菌細胞中 CRISPR RNA 的一個更短的版本，它能與 Cas 形成復合物，指導 Cas 到達正確的剪切位點。不過研究人員也可以通過結合其它元件，或者改變 Cas 活性，來調整這種工具在基因校正和基因調控方面的作用。

「目前，非傳統基因編輯應用方面的生物學家利用一種新工具，分析細胞中，和整個生物機體中突變的作用」，來自加州大學伯克利分校的生物化學教授Jennifer Doudna 表示，她與她的同事解析了細菌細胞中 CRISPR 的作用機制。近期，Doudna 研究組利用這種工具，首次通過小鼠受精卵基因編輯構建了敲除小鼠。

不過 CRISPR 技術也存在一個主要的缺點，那就是缺乏特異性：一些 gRNA 分子結合的 DNA 只是部分與 gRN 互補。在這一方面，其它基因編輯方法，如鋅指核酸酶（ZFN）和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更為具有優勢，因為這兩者需要識別更長的靶標 DNA 序列。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和細胞表達方面要比 gRNA 難得多，而且研究人員通常還需要驗證十幾個不同的 TALENS，以及幾十個不同的 ZFNs，來證明其中一個有效。

近期《科學家》（The Scientist）雜志匯總了基因編輯過程中 Cas 和 gRNA 的處理過程及解決方案，用於幫助新接觸這一技術的研究人員熟悉這項熱門技術。

如何 CRISPR 我的靶標？
由於 CRISPR 系統並不復雜，因此我們所要做的就是將帶有質粒（能表達 Cas 和 gRNA）的細胞進行轉染。研究人員可以採用一種 Cas 的變體，即 Cas9，這種酶來自於一種鏈球菌，由 RNA 進行指引，能無需其他蛋白的幫助而切割 DNA （Science, 337:816-21, 2012）。Cas9 既能切斷與 gRNA 結合的 DNA 鏈，也能切斷其互補鏈。目前可以從 Addgene 購買 Cas9 質粒（65 美元），將其直接轉染入細胞。

㈦ crispr/cas9到底是什麼東西大家有關於這個的介紹和資料嗎

最近幾年基因編輯技術異常火爆，CRISPR/Cas9技術面世以後，彌補了傳統基因編輯技術的諸多不足，使得基因的「任意編輯」變得越來越容易。也因此，CRISPR/Cas9技術當仁不讓的成為基因編輯技術的「王牌」，大有一副取而代之的勢頭。所以這里就給大家簡單介紹一下CRISPR/Cas9的技術原理！
一、CRISPR/Cas9系統的構成
CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一種來自細菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制。在細菌及古細菌中，CRISPR系統共分成3類，其中Ⅰ類和Ⅲ類需要多種CRISPR相關蛋白（Cas蛋白）共同發揮作用，而Ⅱ類系統只需要一種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應用提供了便利條件。目前，來自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系統應用最為廣泛。
Cas9蛋白（含有兩個核酸酶結構域，可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結合成復合物，然後通過PAM序列結合並侵入DNA，形成RNA-DNA復合結構，進而對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂。
研究人員為了將CRISPR/Cas9技術發展為高效的基因打靶工具，又進行了優化和改造。Cong, L.等人[1]在不影響系統效率的情況下，將crRNA和tracrRNA融合為一條RNA。通過這種簡化，CRISPR/Cas9系統現僅包括兩個元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA）。因此現在人們將CRISPR/Cas9技術也稱為Cas9/sgRNA技術。
二、CRISPR/Cas9技術的基因編輯機制
CRISPR/Cas9通過對預設的DNA位點進行切割，造成DNA雙鏈斷裂（DSB, double strand break）。這種DNA的損傷可以啟動細胞內的修復機制，主要包括兩種途徑：
一是低保真性的非同源末端連接途徑（NHEJ，Non-homologous end joining），此修復機制非常容易發生錯誤，導致修復後發生鹼基的缺失或插入（Indel），從而造成移碼突變，最終達到基因敲除的目的。NHEJ是細胞內主要的DNA斷裂損傷修復機制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的實現移碼突變，從而制備基因敲除模式動物。CRISPR/Cas9技術的出現，使得無需再使用相應物種的ES細胞系就可以制備基因敲除模式生物，且已成功應用於小鼠[5]、大鼠[6]、豬[7]、靈長類[8]、果蠅[9]等等。
第二種DNA斷裂修復途徑為同源介導的修復（HR, homology-directedrepair），這種基於同源重組的修復機制保真性高，但是發生概率低。在提供外源修復模板的情況下，靶向核酸酶對DNA的切割可以將同源重組發生的概率提高約1000倍[10]。利用這種機制可以實現基因組的精確編輯，如：條件性基因敲除、基因敲進、基因替換、點突變等等。
CRISPR/Cas9技術以自己操作的便捷性，高效的基因編輯能力獲得青睞，成為當下科研工作者的新寵兒。各大實驗室紛紛加入開發CARISPR/Cas9技術的行列中，媒體也將之評為21世紀最有影響的十大技術之一。讓我們跟隨CRISPR/Cas9技術的腳步一起加強科研基礎的建設，推動生物科研的進步！

詳細信息你可以參考：http://www.bbctg.com.cn/show_2/1733.html

㈧ smal限制酶切割位點

（1）質粒上含有兩個SmaⅠ限制酶的切割位點，所以用SmaⅠ限制酶處理圖甲所示的質粒會得到2個DNA片段；圖乙所示的外源DNA含有一個AluⅠ限制酶的切割位點，所以用AluⅠ處理外源DNA會形成兩個黏性末端，增加2個游離的磷酸基團．
（2）外源DNA含有四個酶切位點，即SmaⅠ、AluⅠ、PstⅠ和HindⅢ酶，其中AluⅠ酶的切割位點位於目的基因上，所以不能用此酶切割；用SmaⅠ酶切割會將質粒上兩個標記基因均破壞，所以不能用SmaⅠ酶切割；應選用 PstⅠ和HindⅢ酶同時酶切質粒和含目的基因的外源DNA，這樣可以避免目的基因和質粒在酶切後產生的片段發生自身環化或任意連接，也便於篩選需要．如果是用PCR技術擴增目的基因，設計引物是關鍵，但在擴增時退火溫度一般為55～60℃，對於（A+T）%>50%，一般用55℃；（A+T）%≤50%時一般用60℃，原因是G與C之間是三個氫鍵，所以C和G比例越高，DNA越穩定．
（3）用 PstⅠ和HindⅢ酶同時酶切質粒，會破壞氨苄青黴素抗性基因，但沒有破壞四環素抗性基因，所以導入重組質粒的大腸桿菌能抗四環素，但不能抗癌變青黴素．為了篩選獲得含有重組質粒的大腸桿菌，首先將經轉化處理過的大腸桿菌接種在含四環素的培養基中，然後用影印法將該培養基上的菌落按原來的方向印在含氯黴素培養基上，以篩選獲得含重組質粒的細菌．在含四環素培養基中能生長繁殖，而在含氯黴素培養基中不能生長繁殖的是導入了重組質粒的大腸桿菌．
（4）因為大腸桿菌細胞內缺乏內質網與高爾基體，不能對多肽鏈進行折疊、組裝與修飾，所以在上述導入了重組質粒的大腸桿菌菌株中，目的基因正常轉錄形成了mRNA，但其所控制合成的蛋白質卻並不具有生物活性．
故答案為：
（1）22
（2）PstⅠ和HindⅢ酶G與C（之間是三個氫鍵）比例越高越穩定
（3）四環素氯黴素重組質粒（或目的基因）
（4）大腸桿菌細胞內缺乏內質網與高爾基體（或大腸桿菌缺乏生物膜系統），不能對多肽鏈進行折疊、組裝與修飾

㈨ crispr系統中sgrna和grna一樣嗎

sgrna是single guide RNA（單導向RNA）的縮寫。在CRISPR/Cas9系統中sgRNA與gRNA是一個概念。

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是原核生物基因組內的一段重復序列，是生命進化歷史上，細菌和病毒進行斗爭產生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合到細菌，利用細菌的細胞工具為自己的基因復制服務。

細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出CRISPR-Cas9系統，利用這個系統，細菌可以不動聲色地把病毒基因從自己的基因組上切除，這是細菌特有的免疫系統。

擴展知識：

功能特點：

CRISPR是生物科學領域的游戲規則改變者，這種突破性的技術通過一種名叫Cas9的特殊編程的酶發現、切除並取代DNA的特定部分。這種技術的影響極其深遠，從改變老鼠皮毛的顏色到設計不傳播瘧疾的蚊子和抗蟲害作物，再到修正鐮狀細胞性貧血等各類遺傳疾病等等。

該技術具有非常精準、廉價、易於使用，並且非常強大的特點。

CRISPR來自微生物的免疫系統，這種工程編輯系統利用一種酶，能把一段作為引導工具的小RNA切入DNA，就能在此處切斷或做其他改變。以往研究表明，通過這些介入，CRISPR能使基因組更有效地產生變化或突變，效率比TALEN（轉錄激活因子類感受器核酸酶）等其他基因編輯技術更高。

雖然CRISPR有許多優點，在人類癌細胞系列中，它也可能產生大量「誤傷目標」，尤其是對不希望改變的基因做修改。

㈩ crispr/cas9的應用

基因敲除動物模型一直以來是在活體動物上開展基因功能研究、尋找合適葯物作用靶標的重要工具。但是傳統的基因敲除方法需要通過復雜的打靶載體構建、ES細胞篩選、嵌合體小鼠選育等一系列步驟，不僅流程繁瑣、對技術的要求很高，而且費用大，耗時較長，成功率受到多方面因素的限制。即使對於技術比較成熟的實驗室，利用傳統技術構建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。
2013 年 1 月份，美國兩個實驗室在《Science》雜志發表了基於 CRISPR-Cas9 技術在細胞系中進行基因敲除的新方法，該技術與以往的技術不同，是利用靶點特異性的 RNA 將 Cas9 核酸酶帶到基因組上的具體靶點，從而對特定基因位點進行切割導致突變。該技術迅速被運用到基因敲除小鼠和大鼠動物模型的構建之中。通過一系列研究，首先證明了通過 RNA 注射的方式將 CRISPR-Cas 系統導入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中產生定點突變。在此基礎上，又發現了該方法沒有小鼠遺傳品系的限制，能夠對大片段的基因組 DNA 進行刪除，也可以通過同時注射針對不同基因的 RNA 序列達到在同一隻小鼠或大鼠中產生多個基因突變的效果。此外，還證明了利用 CRISPR-Cas 技術構建的基因敲除大鼠模型與傳統方法構建的同一基因（肥胖相關 G 蛋白偶聯受體 Mc4R）突變大鼠相比具有一致的表型。該方法構建的基因突變動物具有顯著高於傳統方法的生殖系轉移能力，是一種可靠、高效、快速的構建敲除動物模型的新方法。
CRISPR-Cas 技術是繼鋅指核酸酶（ZFN）、ES 細胞打靶和 TALEN 等技術後可用於定點構建基因敲除大、小鼠動物的第四種方法，且有效率高、速度快、生殖系轉移能力強及簡單經濟的特點，在動物模型構建的應用前景將非常廣闊。