GSDME如何被caspase3切割

A. 哪位高人做過caspase-3，caspase-8，caspase-9的WB，請指點一下

天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartate-specific proteases，caspase，)caspase是一類蛋白酶家族，成員較多，在人類，已經鑒定內了10種不同的容caspase。各種caspase都富含半胱氨酸，它們被激活後，能夠在靶蛋白的特異天冬氨酸殘基部位進行切割。在正常的細胞內，每一種caspase都是以非活性狀態存在的，這種非活性的caspase稱作酶原（zymogen），它是酶的非活性前體，其肽鏈比有活性時長一些，將多出的部分切除，就轉變成有活性的caspase。有兩類caspase，一類是起始者（initiators）,另一類是執行者（executioners）,起始caspase在外來蛋白信號的作用下被切割激活，激活的起始caspase對執行者caspase進行切割並使之激活，被激活的執行者caspase通過對caspase靶蛋白的水解，導致程序性細胞死亡。

B. westerncleaved-caspase8條帶怎麼分析

我的分析如下：

1、分為pro-Caspase8和active/cleaved-Caspase8兩種形式，前者是Caspase8前體，而後者在凋亡因素誘導pro-Caspase8大量聚集後產生的。

2、正常情況下pro-Caspase8位於胞漿內，當凋亡啟動時，大量的pro-Caspase8降解產生active-Caspase8，發生胞漿-胞膜之間的轉移。

3、此外，我猜測會不會凋亡發生時，核膜和線粒體膜發生破裂，部分active/cleaved-Caspase8發生位移到核內。不知你做的是哪一種Caspase8？

附上一篇綜述，僅供參考： http://gene.bjmu.e.cn/news/caspase.htm

凋亡（或程序性細胞死亡）是一個生理性的細胞自我毀滅的過程，在胚胎發育、生物體內環境的穩定及多細胞生物防禦外在及內在傷害方面均起著非常重要的作用。凋亡過程的紊亂，可能與許多疾病的發生有直接或間接的關系，如腫瘤、自身免疫性疾病、神經退行性變及局部損傷等[1]。能夠誘發細胞凋亡的因素很多，如射線、能夠引起染色體損傷的葯物、細胞自身表達的一些受體分子等。凋亡細胞表現出一些共同的特徵，如形態學的改變（包括胞膜小泡的形成，細胞的皺縮，凋亡小體的形成），生物化學特性的改變（如胞膜內環磷脂醯絲氨酸的外翻，DNA的片斷化，細胞骨架的解離，細胞內功能蛋白的降解等）[2]。對細胞凋亡的機制，人們進行了深入的研究，在以往研究的基礎上，大致可以把凋亡分為Caspase依賴的和非Caspase依賴的凋亡。本文著重對Caspase依賴的凋亡過程中的Caspase分子特性作一綜述。
Caspase分子是一類在進化上非常保守的蛋白酶類分子。Caspase的含義表現在兩個方面（1）他們為半胱苷酸蛋白酶類，並且把半胱氨酸作為對底物裂解時的親核基團，（2）他們為天冬氨酸蛋白酶類，切割天冬氨酸的羧基與下一個氨基酸的氨基形成的肽鍵。人們對Caspase在凋亡中起重要作用的認識來自於一些試驗觀察（1）天然和合成的Caspase抑制劑可以顯著降低甚至阻斷多種刺激引起的細胞凋亡，（2）一些Caspase基因敲除動物模型表現出明顯的無凋亡現象，（3）Caspase催化裂解眾多的細胞內功能蛋白分子，這些裂解的分子可以導致細胞凋亡[3]。Caspase分子除了在凋亡過程中起重要作用外，在炎症過程中也起重要作用。Caspase分子以酶原的形式被合成，並且在體內低水平組成性表達。外部或內部的刺激引起Caspase分子以瀑布式的活化方式活化。活化的Caspase分子催化裂解眾多的效應分子，誘發細胞凋亡。
Caspase的結構和酶活性

自從第一個Caspase分子（Caspase－1）被發現以來，在哺乳動物已經發現了14種同源分子，在果蠅中發現了5種同源分子。從結構上進行分析，這些同源物均含有一個高度同源的酶活性區域，該區域可以被切割為大約20KD和10KD的兩個片斷，在一些Caspase分子如Caspase－3，大小兩個片斷以Linker相連。根據Caspase分子酶活性區域的相似性，可以把Caspase分子分為三大類（1）與炎症有關的Caspase分子，包括Caspase-1、-4、-5、-11、-12、-13和-14，（2）包括Caspase-2和-9，（3）包括Caspase-3、-6、-7、-8、-10。Caspase分子的另外一個顯著特點是以酶原的形式被合成，這些酶原的氨基端有一段長短不一的肽段，被稱為Prodomain。Prodomain與Caspase分子功能密切相關。與炎症相關的Caspase分子的Prodomain長度大於100個氨基酸，而功能性Caspase分子的Prodomain長度則小於30個氨基酸。長的Prodomain往往含有明顯的功能域，如DED（death effector domain）,CARD(Caspase recruitment domain)，DID(death incing domain)等。Caspase-8和-10均含有兩個重復的DED功能域，而Caspase-1、-2、-4、-5和-9均含有CARD功能域，在果蠅的DREDD中含有DID功能域。這些功能域參與Caspase分子之間的相互作用及Procaspase DE活化及Caspase分子的亞細胞定位等[4,5,6,7,8]。短的Prodomain的功能可能是抑制Caspase的活化[9]。最近的研究發現Linker中的一些氨基酸序列也有明顯的生物學作用，如Caspase-3的Linker中的DDD序列參與Procaspase-3的穩定[10]。Procaspase分子的三維結構人們目前還無法知道，但DED，CARD等功能域的三維結構已經被認識，他們均由6個a－螺旋構成，外形上非常相似，但仍有一些差異，主要表現為功能域相互作用的方式不盡相同。如電荷－電荷相互作用主導CARD-CARD之間的作用，而疏水相互作用主導DED-DED之間的作用 [11,12,13]。
對活化Caspase的結構的研究發現，活化Caspases均為由大小兩個亞基構成的異四聚體，大小兩個亞基對於酶的活性均是必需的。利用Caspase的抑制物已經將一些活化Caspase分子的三維結構研究的比較清楚。如Caspase-8，Caspase-3等。這些研究顯示，活化Caspase為四聚體，兩個小亞基相鄰排列，兩個大亞基圍繞在小亞基的周圍；每一大小亞基形成一球狀分子，球狀分子的核心為6個α螺旋環繞的6個β片層樣結構。兩個異二聚體以小亞基相連。每一活化Caspase分子含有兩個酶活性中心，這兩個活性中心可能獨立發揮作用。在Caspase-1分子中，Cys-285，His-237， Arg-179（大亞基）和Arg-341（小亞基）組成酶的活性中心。結構研究還顯示，在Procaspase到活化Caspase的過程中，大亞基的羧基端和小亞基的氨基端順勢相鄰有利於形成正確的酶活性中心[14,15,16,17,18]。對Caspase酶活性中心的研究主要是依靠特異性抑制劑及突變技術。如在對Caspase-1的研究中，發現Caspase-1的活性可以不可逆的被半胱苷酸蛋白酶抑制劑（帶重氮甲基酮的多肽）所抑制，起他的能夠修飾半胱氨酸的類似物如碘乙醯胺、N－乙醯馬來醯亞胺也可以抑制Caspase-1的活性；其他一些絲氨酸、天冬氨酸、金屬蛋白酶抑制劑不能抑制Caspase-1的活性。以上結果被突變技術及三維結構的研究所證實。與其他半胱氨酸蛋白酶相類似，Caspase分子對過渡期金屬元素比較敏感，如Zn2+ 可以明顯抑制多種因素誘導的凋亡，其機制可能是Zn2+干擾了活性中心的正確形成 [19,20] 。
Caspase分子是非常特異的內肽酶，其酶作用的底物要有四個排列正確的四個氨基酸及相鄰氨基酸[21,22]。如圖所示，P1位必須是天冬氨酸，P2、P3、P4位上氨基酸的組成，不同的Caspase分子的要求不同。應用positional scanning synthetic combinatorial library(PS-SCL)的方法[23]，我們現在已經可以對不同的Caspase分子的底物特異性有一大概了解。根據Caspase對底物的識別不同，Caspase分子可以分為三大類，第一類的特異識別位點是WEHD，包括Caspase-1、-4、-5。第二類的特異識別位點為DETD，包括Caspase-2、-3、-7、CED3。第三類的特異識別位點為（L/E）EXD，包括Caspase-6、-8、-9、-10。以上僅僅是粗粗的分類，其實，同一類的不同的Caspase分子對相同的底物的親合力是不同的，如Caspase-1和Caspase-4對WEHD的親合力常數分別為0.056和97，這說明Caspase-1比Caspase-4的酶活性更強[24]。除了P1-P4位外，P1′（切割位點後的第一個氨基酸）的氨基酸種類也很有特點，常常為Ala、Ser、 Asn等小分子的氨基酸。在體外試驗中，P1′位只要是甲醯胺就足以引起正確地切割。必須注意的是，體外實驗的結果並不能完全代表體內實驗的結果，因為在體內，酶對底物的切割更易受到蛋白分子內相鄰氨基酸殘基的影響。
Procaspase的活化

盡管人們對凋亡的機制及Caspase分子特性了解很多，但Caspase分子是如何被活化的，仍是一個有爭論的話題。對initiator caspase的活化始於對caspase 在大腸桿菌表達的研究．這些表達的procaspase分子能夠完全和准確的活化，但是在這些研究中，所使用的蛋白濃度非常高，並不能代表細胞內的真正情況．對procaspase的真正意義上的活化的研究始於procaspase-8．當受到FasL的作用後，Fas的細胞內肽段募集Procaspase-8，引起Procaspase-8的寡聚化，繼而活化。由此提出Procaspase-8的活化是由於其寡聚化引起的，體外實驗中寡聚化可以引起caspase－8的活化。Procaspase-9的活化是由於Apaf-1引起其寡聚化後而活化的。事實上，由寡聚化而使蛋白活化是細胞內的一個廣泛的機制。但近來的研究卻發現，由突變引起的Processing位點缺失的Procaspase-9仍能誘導凋亡，而且其Prodomain參與全酶的形成。這些結果提示Initiator caspase的自我切割並不是寡聚化介導的caspase活化的首發條件。另外一個利用定點突變方法是相鄰的Procaspase分子一個缺失Processing位點，另一個缺失酶活性位點，均不能使兩個Procaspase分子活化。這些結果似乎提示還有其他活化Procaspase的途徑[25,26,27,28]。
效應caspase的活化可能有兩條途徑：一是由Initiator caspase對其切割後活化的，另外是通過反式活化途徑。現在已經證明了的活化途徑包括受體介導的caspase的活化和線粒體介導的caspase的活化。反式活化需經兩個步驟。以顆粒酶B對caspase-3的活化對反式途徑加以描述。顆粒酶對caspase-3的切割首先發生在Linker區域，產生一個具有部分酶活性的中間體，該中間體與成熟酶在結構上很相似，然後，中間體進行自我切割，切去Prodomain，形成活化的caspase-3。IAPs（inhibitor of apoptosis）對caspase的抑製作用之一就是抑制Prodomain的自我切割[29,30,31,32]。非常有意思的是，Procaspase-3可以被含有R-G-D Motif的短肽所活化，該種活化機制不清，但Procaspase-3在活化部位的RGD motif及linker區域中所含有的RGD結合序列，可能參與了這種作用。
Caspases 分子在凋亡過程中的位移

Procaspases分子為細胞的組成性表達分子，主要分布於胞液中。在各種刺激誘導的細胞凋亡過程中，不同的caspases分子位移到不同的亞細胞區域，發揮不同的作用。
胞漿－胞膜之間的位移?caspase-8主要介導由受體誘導的細胞凋亡，在正常情況下存在於胞漿中。當受到配體的作用後，受體的胞內肽段的DD Domain的抑制因子SODD解離。在伴侶分子FLASH的陪伴下，procaspase-8通過其prodomain中的DED結構域與受體的DD domain相互作用，在胞膜內的局部區域聚集，導致procaspase-8的活化，活化的caspase-8再返回胞漿，激活下游的caspase分子[33]。
胞漿、線粒體和核之間的位移?caspase-9是個多功能的分子，間接活化caspase-2、-6、-8、-10，直接活化caspase-3、-7。在許多腫瘤細胞系中，procaspase-9分布於胞漿中，但在部分細胞系及肝臟細胞提取的線粒體中，發現procaspase-2、-9存在於膜間隙中，當細胞受到細胞毒性葯物襲擊後，線粒體外膜破壞，procaspase-2、-9移位到胞漿中，進行活化。另外，在培養及活體的心肌細胞及神經元細胞中，procaspase-9幾乎全部位於線粒體中。與通常所理解的procaspase-9的作用不同，心肌細胞的procaspase-9移位到細胞核中。procaspase-3主要在胞液中，但一些研究者在部分細胞系及肝細胞的線粒體中，發現有10-90%不等的procaspase-3分布於線粒體的膜間隙中，這還是一個有爭議的結果，因為另外一些研究者得到的是陰性結果。procaspase-7是目前直到的唯一位移到微體的caspase分子，細胞受到FasL作用後，procaspase-7被活化後，移位到微體中。Caspase-3和caspase-7切割的底物相同，但在細胞內的定位不同。最近的研究發現，caspase-2可以易位到高爾基體中，並對特異底物Golgin-160進行切割。[34,35]
Caspases 分子的核轉位?在細胞凋亡的過程中，細胞核的形態學和生化特性都發生了很大的變化，這些變化有些是核內的功能性蛋白直接被切割降解失活引起的，如Lamins,Poly(ADP-ribose) polymerize,DNPK,Rb和DNA topoisomeraseI等，有些則是caspase 的切割激活了一些內切酶類，如ICAD/CAD。已經發現可以核轉位的caspase分子有caspase-1、-2、-3、-6和-9。Caspase核轉位的機制還不是特別清楚。已知caspase核轉位的機制大致可以歸為Prodomain介導的和自由擴散兩種。Procaspase-1、-2、和-9的長的Prodomain中含有核定位信號，可以輔助caspase的入核。Caspase-3的入核機制還在爭論中，有的研究認為該過程是一個主動需能的過程，但最近的對MCF-7DE研究結果卻發現，caspase-3的核轉位是由於活化的caspase-9破壞了細胞的核屏障作用，導致了caspase-3在核漿之間的自由擴散[36]。
Caspases分子的調控

由於功能上的多樣性和對細胞作用的不可逆性，caspase分子在細胞內受到精細的調控。根據調控的方式不同，大致可以分為以下三類：（1）caspases 分子一級結構內所含的特異基序，調控caspase 活性，（2）由調控分子直接作用與caspase 分子進行的調控，（3）對caspase的修飾作用。
對caspase一級結構所包含的調控信息現在了解的不是很多。已經知道，caspase―3的Prodomain可以抑制caspase－3的活化，使caspase－3保持在靜止狀態。對caspase的一級結構的研究還發現，在caspase－1、2、3、7分子中含有RGD基序，而在caspase―3的分子中，還發現有RGD的結合序列DDM, RGD和DDM的相互作用可以促進caspase－3的自身活化[37]。為了抑制caspase分子在正常情況下的自我催化作用，在caspase－3分子的linker序列中，包含有DDD基序，可以抑制caspase－9、顆粒酶B介導的活化，及caspase－3的自身活化。在caspase－7的Linker區發現了相似的基序DTD，提示利用一級結構的某些基序來調控caspase是一個廣泛的機制[10]。
現在已知的直接作用與caspase並調控其功能的分子很多。理論上，對一個代謝通路的調節包含有正、負兩種方式，但在caspase的調控研究中，除了我們剛剛發現的一個正調控分子TFAR19外，其餘均為負調控因子。
TFAR19為一個有125個氨基酸的酸性蛋白質，在體內廣泛分布，在胞漿合成，利用反義寡核甘酸技術發現TFAR19可以促進由etoposide等topoisomeraseⅡ抑制劑誘導的凋亡，對其作用的分子機理的研究發現TFAR19直接作用與caspase－3，促進caspase－3的活性。對TFAR19的作用機理的研究還在進行。通過對其的研究，可能會促進對caspase－3正調控機理的研究。
Caspase的負調控分子有很多。如選擇性作用於一、三類caspase的CrmA(來自牛痘病毒的絲氨酸蛋白酶抑制劑)，主要選擇性的作用於二類caspase的IAP超家族成員，來自於桿狀病毒caspase的廣泛抑制分子p35。CrmA和p35分子作為caspase的競爭性抑制劑，抑制caspase的活性。
IAP超家族的成員較多，如c-IAP1, c-IAP2,XIAP, NIAP 和Survivin，新的成員在不斷的被發現，如新發現的Livin分子[38]。IAP家族成員有一個共同的特徵，含有一個或多個70個氨基酸的重復序列（BIR），類似於zinc指狀的結構。c-IAP1、 c-IAP2和 XIAP含有環指裝結構。BIR功能域和之間的連接區域介導對caspase的抑製作用，而環指狀結構則具有泛素化蛋白連接酶的作用，介導caspase－3和－7的泛素化降解作用[39]。
Caspase的負調控分子還包括caspase的變異體。如已經發現caspase-8有8種變異體[40]，這些變異主要包括N端的缺失或序列變異。Caspase－9的變異體caspase－9beta缺乏活性區，為caspase－9的內源性負調控因子[40]。
Caspase的調控還包括轉錄後修飾作用。如Akt 和p21-RAS 可以誘導procaspase-9 Ser196的磷酸化，抑制procaspase-9的活化。Ser196的突變可以抑制Akt的磷酸化作用，促進凋亡[41]。在部分未被刺激的細胞中，procaspase-3活性中心的半胱氨酸被亞硝基化，Fas誘導的caspase的活化可以使procaspase-3去亞硝基化，使procaspase-3活化[42]。
總之，作為決定細胞命運的活性分子，Caspase具有復雜的功能和調控方式。人們對Caspase分子的了解還剛剛開始，對其的進一步了解將會幫助我們認識疾病，治療疾病。

C. caspase3試劑盒與caspase4有什麼不同

Caspase是一類蛋白酶家族，成員較多，在人類，已經鑒定了11種不同的caspase，根據其蛋白酶序版列的同權源性可分為3個亞族：Caspase-1亞族包括 Caspase-1、4、5、11；Caspase-2亞族包括Caspase-2、9； Caspase-3亞族包括Caspase-3、6、7、8、10。
特性
各種Caspase都富含半胱氨酸，它們被激活後，能夠在靶蛋白的特異天冬氨酸殘基部位進行切割。在正常的細胞內，每一種caspase都是以非活性狀態存在的，這種非活性的caspase稱作酶原（zymogen），它是酶的非活性前體，其肽鏈比有活性時長一些，將多出的部分切除，就轉變成有活性的caspase。
分類
有兩類Caspase，一類是起始者（initiators）,另一類是執行者（executioners）,起始Caspase在外來蛋白信號的作用下被切割激活，激活的起始Caspase對執行者Caspase進行切割並使之激活，被激活的執行者Caspase通過對caspase靶蛋白的水解，導致程序性細胞死亡。