切割基因的酶有什麼

1. 基因工程中,常用來切割dna分子特異序列的酶是

構建基因表達載體時，首先要用同一種限制酶切割含有目的基因的DNA片段和質粒，以產生相同的黏性末端；然後還需要用DNA連接酶連接目的基因與質粒形成重組DNA分子．
故選：C．

2. 獲得目的基因地方法有哪兩種切割和連接分子所使用得酶分別是什麼

根據所需目的基因的來源,有分離自然存在的基因或人工合成基因.常用的方法有PCR法、化學合成法、cDNA法及建立基因文庫的方法來篩選.
切割和連接分子所使用得酶根據不同的題目有所不同.

3. 切割DNA用什麼酶比較好

限制性核酸內切酶

4. 基因剪刀是什麼酶

考點復： 基因工程的原理及技術 專題：制 分析： 基因工程中要對目的基因進行切割、改造、修飾和拼接，然後導入受體細胞，使重組DNA分子在細胞中表達．要實現這一精確的操作過程至少需要三種工具：准確切割DNA的「手術刀」--限制性核酸內切酶，將DNA片段連接起來的「縫合針」--DNA連接酶，將體外重組好的DNA導入受體細胞的「運輸工具」--基因的載體． A、DNA連接酶能夠將限制酶切割的末端連接，是基因工程的「縫合針」，A錯誤；B、DNA聚合酶一般用於合成DNA，不屬於基因工程的操作工具，B錯誤；C、蛋白質水解酶用於水解蛋白質，不屬於基因工程的操作工具，C錯誤；D、限制性核酸內切酶內特異性識別特定的核苷酸系列，在基因工程能夠在特定的核苷酸序列出切割質粒和目的基因，故稱為基因工程的「剪刀」，D正確．故選：D． 點評： 本題考查基因工程相關知識，考生要能夠識記基因工程三種工具的作用，能夠根據作用的特點對應「手術刀」、「縫合針」和「運輸工具」，屬於簡單題．

5. 基因工程研究中需要哪幾類酶，這些酶各有什麼作用

用於基因工程的工具酶
一,限制性內切酶(Endonucleosase)
(一)限制性內切酶(Endonucleosase)的發現與分類
1) 50年代初發現細菌能將外來DNA片段在某些專一位點上切斷,從而保證其不為外來噬菌體所感染,而其自身的染色體DNA由於被一種特殊的酶所修飾而得以保護,這種現象叫做限制-修飾,它們由三個基因位點所控制:hsd R, hsd M, hsd S, 十年後,人們搞清了細菌的限制與修飾分子機理:
hsd R---限制性內切酶
hsd M---限制性甲基化酶
hsd S---控制兩個系統的表達
1968年Smith等人從流感嗜血桿菌株中分離出兩個類內切酶,Hind II和Hind III,為基因工程技術的誕生奠定了基礎.
截止到目前為止,已經分離出400餘種II類酶,搞清識別位點的有300種,商品化的約有一百種,而實驗室常用的有二十種 .
2)限制性核酸內切酶可分為三大類:
I類 能識別專一的核苷酸順序,並在識別點附近切割雙鏈,但切割序列沒有專一性.
II類 識別位點(迴文序列)嚴格專一,並在識別位點內將雙鏈切斷
III類 識別位點嚴格專一(不是迴文序列),但切點不專一,往往不在識別位點內部.
因此在基因工程中具有實用價值的是II類限制性內切酶.
(二)II類限制性內切酶的命名及特性
命名原則:取屬名的第一個字母大寫,取種名的前兩個字母小寫,構成基本名稱.該種中發現的不同的酶按照順序編號I, II, III等.如存在變種和品系,取變種或品系的一個字母.若酶存在於質粒上,則需大寫字母表示非染色體遺傳因子.
如,HindIII從Haemophilus Influenzue d株中分離的第三個酶.EcoRI表示基因位於Escherichia coli中的抗葯性R質粒上.
(三)II類限制性內切酶的底物識別順序及切割位點
絕大多數的II類限制性內切酶在底物DNA上的識別順序長度為4,5,6鹼基對,這些鹼基對的順序呈迴文結構(Palindromic),而且切點就在其內部,如EcoRI 5'-GAATTC-3' .
DNA被限制性內切酶切開之後,呈現兩種斷口:
鈍端(平端)如Pvu II, Alu I, EcoR V等
粘端(粘性末端)如:EcoR I等
圖2-1 限制性內切酶產生的末端
(四)識別位點在DNA分子中的頻率
對於特定的限制性酶在DNA分子中的識別位點數目是可以計算的,四鹼基的酶平均大約每256個核苷酸(44)有一個識別位點,而六鹼基的酶大約4096(46)個核苷酸有一個識別序列,計算是在假定核苷酸隨機排列的情況下進行的.實踐中這種方法不完全正確,如λ DNA長49kb,對於六鹼基的酶應該有12個切割位點,實際上要少一些,如Bgl II只有6個,BamHI只有5個,而SalI只有2個.
二,甲基化酶
在專一位點上甲基化,與限制性內切酶相對應.
(一)大腸桿菌中的甲基化酶
dam甲基化酶: 可在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基,這樣可使一些識別順序中含有5'GATC3'的限制性內切酶不能切割來自大腸桿菌的DNA如Bcl I(TGATCA),但BamH I(GGATAA)則不會因為N6A的甲基化而失去活性,因為這兩種酶對底物的特異性不同.
dcm甲基化酶 此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基,受其影響的限制性內切酶是EcoR II.
(二) 甲基化酶在基因工程中用途
許多II類限制性內切酶,都存在著相對的甲基化酶,它們可修飾限制酶識別順序中的第三位腺嘌呤上,封閉酶切位點,從而使其免受切割.如:M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基轉移到EcoRI識別順序中的第三位腺嘌呤上,從而使DNA免受EcoRI的切割.
三,T4-DNA連接酶(T4-DNA Ligase)
來源於T4噬菌體感染的大腸桿菌,連接修復3'端羥基和5'端磷酸基因,脫水形成3'-5'磷酸二酯鍵
連接雙鏈DNA上的單鏈缺口(Nick),因此亦可連接限制內切酶所產生的粘性末端
連接RNA模板上的DNA鏈缺口
連接平頭雙鏈DNA速度很慢,在高濃度的底物和酶的作用下方可進行,這屬於分子之間的連接.
圖2-2 連接酶的作用方式
四,核酸酶
作用: 降解磷酸二酯鍵
分為:外切酶 內切酶
(一) Bal 31(來自於細菌Alteromonas espejiana) 單鏈特異的核酸內切酶活性,雙鏈特異的內切酶活性.依賴於Ca2+
用途:
構建限制酶圖譜
產生末端缺失突變
DNA超螺旋線性化
(二)E. coli外切酶III
只降解DNA分子的一條鏈,產生單鏈的DNA分子.
(三)S1核酸酶(來源於米麴黴菌)
特性:
1. 降解單鏈DNA或RNA,降解DNA的速度大於降解的速度
2. 降解發生的方式為內切和外切
3. 酶切活性需4.0-4.5pH環境,Zn2+激活
4. 酶量過大時會降解雙鏈核酸,因為雙鏈降解活性比單鏈低75000倍
(四) DNase I: 來自於牛胰腺, 既可以降解單鏈也可以降解雙鏈,沒有特異性,產生單核苷酸或短鏈
五,聚合酶
(一)DNA聚合酶I
5'-3'聚合酶活性
3'-5'外切酶活性
5'-3'外切酶活性
核酸內切酶活性
可以被枯草桿菌蛋白酶水解成:Klenow片段和N端具5'-3'外切酶活性的分子.
圖2-3 DNA聚合酶I
(二) Klenow酶
該酶無5'-3'外切活性,保留了5'-3'聚合活性及3'-5'外切活性,基因工程中利用該酶:
修復限制性內切酶造成的5'突出的粘性末端
標記DNA探針
催化cDNA第二條鏈的合成
末端終止法測序
圖2-4 Klenow 酶的作用方式
(三) T4 DNA聚合酶
與Klenow酶相似,外切酶活性更高.體外誘變反應中效率很高.
(四)T7 DNA聚合酶
測序酶
(五) Taq DNA聚合酶
耐高溫,主要用於PCR反應.
(六) 逆轉錄酶:將mRNA轉錄成cDNA
AMV逆轉錄酶(鳥類成髓細胞性白血病病毒)
DNA聚合酶活性
RNase H活性
DNA內切酶活性
核酸結合活性
M-MLV逆轉錄酶(Moloney鼠白血病病毒)
兩種逆轉錄酶的區別
肽鏈的組成
禽酶2條肽鏈,具聚合酶和很強的RNase H活性
鼠酶1條,較弱的RNase H活性
反應的最適溫度
禽酶42°C,二級結構豐富RNA,禽酶效率高
反應的最適pH值
禽酶pH 8.3
鼠酶pH 7.6
六,DNA修飾酶
有大量的修飾酶,主要的有以下幾種:
1) 鹼性磷酸酯酶(來自於大腸桿菌或小牛腸道)可以去掉DNA分子的5'端的磷酸基團.
2) polynucleotide kinase: 來自於T4侵染的大腸桿菌,在5'端增加磷酸基團.
3) 末端脫氧核苷酸轉移酶(terminal deoxynucleotidyl tansferase) 來自於小牛胸腺組織,在DNA分子的3'端增加一個或多個脫氧核苷酸.
4) Topoisomerase改變共價閉合雙鏈DNA分子的結構
第二節 DNA的切割反應
一,緩沖系統的組成
II類酶的酶活條件:Tris-HCl PH7.5, 25-50mM;10mM MgCl2 ;NaCl 0-150mM; DTT 1mM
根據不同酶對鹽離子要求不同,可將緩沖液分為以下三種情況:
高鹽:100-150mM
中鹽:50-100mM
低鹽:0-50mM
二,酶切操作
DNA量的確定,加入酶量的確定,發應體積的確定(20μl),反應時間的確定,1-1.5hr,一般為37℃,但也有例外,如Taq I在65°C時活性最高.
單位限制性內切酶定義為:在最佳緩沖系統和20μl體積中反應1小時,完全水解1μgDNA所需的酶量.
三,酶切結果分析
(一) 酶切片段的檢測
1) 通過凝膠電泳分離,根據分子量分離.根據凝膠的濃度可以分離不同分子量的片段,聚丙烯醯胺凝膠電泳可以分離1-300bp的分子.
2) DNA分子的檢測 a. 染色EB,DNA分子小於25ng,很難檢測到
b. 放射性自顯影, 可以監測少到2ng DNA分子.
(二)估計DNA分子的大小
根據DNA分子的遷移率,可以用公式計算出分子量D=a-b(logM)
D是移動的距離,M是分子量,a, b是恆量但隨著電泳條件的改變而改變.
也可以根據已知大小的片段進行比較,誤差約在5%左右.
四,多酶聯合酶解
對於對濃度要求相同的酶,原則上可以同時酶解;
對於對濃度要求不同的酶,可以:
1. 低鹽濃度的酶先切,後補加NaCL
2. 一種酶切後,換緩沖液,加5mM NaAc 0.1體積,2體積乙醇,冰浴5min,4℃離心10min,乾燥
五,定位酶切位點
建立酶切圖譜需要一系列的酶.
首先確定每一種酶切後產生的分子量和片段的數目;
然後進行雙酶切;
比較酶切和雙酶切的結果,繪制酶切圖譜;
含糊的位點可以通過部分酶切解決,可以短時間的酶切或者在4°C條件下進行.
六, 限制性內切酶的star活性
在PH不合適,或甘油濃度過高≥10%時,限制性內切酶的切割位點會出現非專一性,因此應確保酶的體積為總體積的十分之一以下.
第三節 DNA片段的連接
重組DNA分子構建的最後一步是連接,通過連接酶完成.相對而言,鈍端的連接效率較低,因此一般提高DNA濃度的方法增加接觸的機會.而粘性末端的連接效率較高,因為兩個粘性末端可以通過氫鍵鹼基互補配對.這種暫時的,鹼基配對結構可以提高連接的效率.在分子克隆的連接方式主要有以下幾種:
一,連接方式
(一)相同粘性末端的連接
來源:
相同的酶
同尾酶
問題:
極性有兩種可能
同尾酶連接後,不能用任何一種酶酶切.稱為"焊死".
(二)平頭末端的連接
粘性末端--分子內部連接,平頭末端--分子間的連接.
提高連接效率的方法:
加大酶用量(10倍)
加大平頭末端底物的濃度
加入10%PEG(8000),促進分子間的有效作用
加入單價陽離子, 150-200mM NaCl
提高反應溫度
平頭連接同樣存在兩種極性
(三)不同粘性末端的連接
突出5'末端
Klenow補平,或S1核酸酶切平,然後平頭連接
突出3'末端
T4-DNApol切平,然後平頭連接
突出末端不同
Klenow補平,或S1核酸酶切平
連接後,可能恢復限制性位點,甚至還可能產生新的位點.XbaI與HindIII( XbaI恢復), XbaI與EcoRI(均保留),BamHI與Bgl II(產生ClaI位點)
(四)人工粘性末端的連接
5'突出的末端
外源片段先用Klenow補平;然後用TdT補加polyC;載體片段也用Klenow補平,加polyG,退火不經連接即可轉化.目的是:不使酶切位點遭受破壞.
3'突出的末端
外源片段先用TdT加polyG;載體片段加polyC;然後退火;再用Klenow補齊;連接
平頭末端
可直接用TdT補加末端,但以加polyA/T為佳.這樣稍微加熱,AT區就會出現單鏈區域,然後用S1核酸酶水解即可回收片段
(五)粘端與平端的連接
linker : 人工合成的,含有限制性內切酶識別序列的,短的雙鏈DNA片段.
– 連接的效率較高
– 酶切時可能破壞DNA分子的完整.
adaptor:人工合成的,具有粘性末端寡聚核苷酸.
圖 2-5 linker的連接方式
(六)粘性末端的更換
在DNA片段上某一酶切口處換成另一種酶切口
– BamHI酶切片段用Klenow補平,或用S1酶切平;連接一段linker或Adaptor,使之產生EcoRI粘性末端.這樣BamHI切口就換成了EcoRI切口 .
– 由AluI更換EcoRI:AluI切開,T4-DNApol切平,另一段DNA EcoRI切開,Klenow補平,連接,原來含有AluI的片段變成含有EcoRI
二,重組率
重組率:連接反應結束後,含有外源DNA片段的重組分子數與加入的載體分子數之比.較為理想的重組率為25-75%
提高重組率的方法:
連接反應條件 外源片段:載體=2:1-10:1(分子數),增加碰撞機會,減少自身環化.
載體除磷 (磷酸酯酶5'除磷).
TdT在3'端增加人工粘性末端,防止載體自我環化 .

6. 基因工程中,切割dna分子特異序列的酶是

一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，並在特定的切點上切割DNA分子，這體現了酶的專一性．
故選：D．

7. 基因工程中的工具酶具體有哪裡分別有什麼作用

目前到高中階段為止有以下幾種酶1限制性內切酶（也叫限制酶），是在轉基因回技術中對細菌的環答狀質粒以及目的基因進行切割的一種，在使用時應注意用同種限制酶切割才會產生相同的粘性末端，一種限制酶只能識別一種序列排列方式，大部分都是迴文序列，像CCGG之類的比較多。2DNA連接酶，是再切割完之後用來將目的基因和質粒進行拼接和粘貼的一種酶，同樣的只能識別特定序列，所以用限制酶的時候我們才應該保證相同的序列以便粘貼，但是注意，這個過程只要有相同的末端就行，所以有可能兩個質粒結合或者兩個目的基因結合，所以還要配合選擇性培養基進行篩選3RNA連接酶，同上了，用處差不多了4DNA聚合酶，是將游離的脫氧核苷酸進行拼接形成DNA片段，這個不同於連接酶的地方是這個連接的是核苷酸，而連接酶連接的是兩個DNA片段，不過都是連接形成磷酸二酯鍵。5水解酶，包括DNA的和RNA的兩個，就是把上面的過程反過來，破壞磷酸二酯鍵了。其他的不大常用，我學到常用的就這些了，望採納。有不懂得我再補充

8. 基因工程中主要的工具酶有哪幾種，它們的作用是什麼

基因工程工具酶主要包括限制酶、聚合酶、連接酶、修飾酶和核酸酶五大類，具體解釋如下：

1、DNA限制性內切酶

生物體內能識別並切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶。它是可以將外來的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入並使之失去活力，但對自己的DNA卻無損害作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳信息；

2、連接酶

它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，藉助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵；

3、聚合酶

系專司生物催化合成脫氧核糖核酸和核糖核酸的一類酶的統稱；

4、核酸酶

核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相應的DNA和RNA，核酸酶S1可降解單鏈DNA和RNA，用量增大也可降解雙鏈核酸，它可用於切去ds-cDNA合成中產生的發夾環；

5、修飾酶

體內有些酶可在其他酶的作用下，將酶的結構進行共價修飾，使該酶活性發生改變，這種調節稱為共價修飾調節。

(8)切割基因的酶有什麼擴展閱讀：

工具酶的相關應用——多重放大技術：

為了獲得更高的檢測靈敏度，將多種信號放大技術結合起來使用是一種有效途徑。基於切刻內切酶與DNA聚合酶組合作用的等溫循環鏈置換放大技術，是近年來被廣泛使用的一種工具酶組合信號放大技術。

該技術的基本原理是：通過鹼基的互補配對雜交形成切刻內切酶的識別位點後，切刻內切酶在該位點對其中的一條核酸鏈進行切刻作用產生3′端為羥基的切口。

聚合酶識別該切口的3′端，以未切割的序列為模板，沿著3′到5′的方向復制聚合置換被切割鏈的另一段序列，最後形成一條完整的雙鏈結構。形成的雙鏈DNA再次被切刻內切酶識別剪切，啟動聚合酶反應。

參考資料來源：網路-工具酶

9. 最好用哪種酶切割質粒，用哪種酶切割目的基因所在DNA

兩種酶同時處理 這樣不會出現三種產物 不會環化 容易得到產物 避免篩選與檢測

10. 切割質粒的酶是什麼

質粒中有兩個抗性基因，一個是四環素抗性基因和氨卞青黴素抗性基因，如果用酶1來切內會破壞兩容個抗性基因，同時把質粒切成兩個片段，所以只能選用酶2，切開一個切口，便於目的基因的插入。同理，目的基因需要用酶1，左右各形成一個切口，這樣才能切下一個目的基因。