cas9如何單鏈切割
1. crispr/cas9的原理
此系統的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通過鹼基配對與 tracrRNA （trans-activating RNA ）結合形成 tracrRNA/crRNA 復合物，此復合物引導核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點剪切雙鏈 DNA。而通過人工設計這兩種 RNA，可以改造形成具有引導作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引導 Cas9 對 DNA 的定點切割。
作為一種 RNA 導向的 dsDNA 結合蛋白，Cas9 效應物核酸酶是已知的第一個統一因子（unifying factor），能夠共定位 RNA、DNA 和蛋白，從而擁有巨大的改造潛力。將蛋白與無核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，並表達適當的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可連接到目標DNA，不影響 Cas9 的結合。因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列處帶來任何融合蛋白及 RNA，這為生物體的研究和改造帶來巨大潛力。
2. 為什麼人類科技這么發達卻無法攻克病毒
地球生命演化的兩個極端，一個走向越來越復雜，比如我們人類，一個走向越來越簡單，比如病毒。
埃博拉病毒，天花病毒、艾滋病病毒，甚至是最近已經在國外失控的新型冠狀病毒，人類對病毒的恐懼比它們帶來的危害更深。
我們的科技已經如此發達了，為什麼我們還沒法攻克病毒呢？我們總結了以下幾點。
最後
隨著人類科技的進步，我們肯定可以找到許多克制病毒的方法，但是，如果你知道抗生素啟示錄的話，你就一定知道，我們使用抗生素可能是在創造超級細菌，那CRISPR和其他方法呢？
病毒是地球最早的「居民」之一，比我們古老太多，而且並不是所有病毒都對人體有害，大多的病毒是對人體是有益的，它們與我們的進化息息相關，人類體內至少40—80%的基因來自病毒。
這兩種進化的極端，這兩個地球的「住人」，好像必然要一戰，但我認為共存比攻克好許多！
3. 如何檢測 crispr 基因敲除成功
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一種來自細菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫機制。在細菌及古細菌中，CRISPR系統共分成3類，其中Ⅰ類和Ⅲ類需要多種CRISPR相關蛋白（Cas蛋白）共同發揮作用，而Ⅱ類系統只需要一種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應用提供了便利條件[1]。
目前，來自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系統應用最為廣泛。Cas9 蛋白（含有兩個核酸酶結構域，可以分別切割DNA 兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結合成復合物，然後通過PAM序列結合並侵入DNA，形成RNA-DNA復合結構，進而對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂。
由於PAM序列結構簡單（5』-NGG-3』），幾乎可以在所有的基因中找 到大量靶點，因此得到廣泛的應用。CRISPR-Cas9系統已經成功應用於植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞，是目前最高效的基因組編輯系統[1]。
通過基因工程手段對crRNA和tracrRNA進行改造，將其連接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有與野生型RNA類似的活力，但因為結構得到了簡化更方便研究者使用。通過將表達sgRNA的原件與表達Cas9的原件相連接，得到可以同時表達兩者的質粒，將其轉染細胞，便能夠對目的基因進行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通過普通質粒,質粒構建流程如下：
Cas9質粒構建
目前常見的CAS9普通質粒有（漢恆生物提供cas9質粒試劑盒）：
雖然普通質粒很多時候也能達到實驗效果，但是質粒轉染具有效率低，作用時間短暫性等缺點。病毒的出現解決了質粒這些問題，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用質粒見addgene（lentiCRISPR v2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast），慢病毒可以整合入宿主基因組中，長期穩定的表達（漢恆生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包裝），但是由於慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比較大（大於4kb），且長期插入可能導致亂切，脫靶等，同時慢病毒包裝最終獲得的滴度不高等原因，腺病毒更有優勢，腺病毒克隆能力強，獲得的病毒滴度也高。同時相對於普通質粒來說，作用是時間也比較長，可以達到更理想的敲除效果。
4. crispr/cas9技術敲除大片段只能切割雙鏈嗎
iOS6我婆婆iOS的咯
5. 如何驗證crisper cas9效果
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一種來自細菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫機制。在細菌及古細菌中，CRISPR系統共分成類，其中Ⅰ類和Ⅲ類需要多種CRISPR相關蛋白（Cas蛋白）共同發揮作用，而Ⅱ類系統只需要一種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應用提供了便利條件[1]。
目前，來自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系統應用最為廣泛。Cas9 蛋白（含有兩個核酸酶結構域，可以分別切割DNA 兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結合成復合物，然後通過PAM序列結合並侵入DNA，形成RNA-DNA復合結構，進而對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂。
由於PAM序列結構簡單（5』-NGG-3』），幾乎可以在所有的基因中找 到大量靶點，因此得到廣泛的應用。CRISPR-Cas9系統已經成功應用於植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞，是目前最高效的基因組編輯系統[1]。
通過基因工程手段對crRNA和tracrRNA進行改造，將其連接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有與野生型RNA類似的活力，但因為結構得到了簡化更方便研究者使用。通過將表達sgRNA的原件與表達Cas9的原件相連接，得到可以同時表達兩者的質粒，將其轉染細胞，便能夠對目的基因進行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通過普通質粒,質粒構建流程如下：
Cas9質粒構建
目前常見的CAS9普通質粒有（漢恆生物提供cas9質粒試劑盒）：
雖然普通質粒很多時候也能達到實驗效果，但是質粒轉染具有效率低，作用時間短暫性等缺點。病毒的出現解決了質粒這些問題，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用質粒見addgene（lentiCRISPR v2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast），慢病毒可以整合入宿主基因組中，長期穩定的表達（漢恆生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包裝），但是由於慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比較大（大於4kb），且長期插入可能導致亂切，脫靶等，同時慢病毒包裝最終獲得的滴度不高等原因，腺病毒更有優勢，腺病毒克隆能力強，獲得的病毒滴度也高。同時相對於普通質粒來說，作用是時間也比較長，可以達到更理想的敲除效果。
6. crispr-cas9 技術可用於大腸桿菌基因敲除嗎
是的，確切來說是大量表達。
大腸桿菌是基因重組技術中常用的細菌，將外源目的內基因(如人胰島容素基因)導入大腸桿菌後可在大腸桿菌內表達目的蛋白(如胰島素)，由於細菌繁殖速度快，通過發酵便可在短時間內獲得大量胰島素，再經多步分離、純化便得到了葯用胰島素。
7. crispr/cas9到底是什麼東西大家有關於這個的介紹和資料嗎
最近幾年基因編輯技術異常火爆，CRISPR/Cas9技術面世以後，彌補了傳統基因編輯技術的諸多不足，使得基因的「任意編輯」變得越來越容易。也因此，CRISPR/Cas9技術當仁不讓的成為基因編輯技術的「王牌」，大有一副取而代之的勢頭。所以這里就給大家簡單介紹一下CRISPR/Cas9的技術原理！
一、CRISPR/Cas9系統的構成
CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一種來自細菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制。在細菌及古細菌中，CRISPR系統共分成3類，其中Ⅰ類和Ⅲ類需要多種CRISPR相關蛋白（Cas蛋白）共同發揮作用，而Ⅱ類系統只需要一種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應用提供了便利條件。目前，來自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系統應用最為廣泛。
Cas9蛋白（含有兩個核酸酶結構域，可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結合成復合物，然後通過PAM序列結合並侵入DNA，形成RNA-DNA復合結構，進而對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂。
研究人員為了將CRISPR/Cas9技術發展為高效的基因打靶工具，又進行了優化和改造。Cong, L.等人[1]在不影響系統效率的情況下，將crRNA和tracrRNA融合為一條RNA。通過這種簡化，CRISPR/Cas9系統現僅包括兩個元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA）。因此現在人們將CRISPR/Cas9技術也稱為Cas9/sgRNA技術。
二、CRISPR/Cas9技術的基因編輯機制
CRISPR/Cas9通過對預設的DNA位點進行切割，造成DNA雙鏈斷裂（DSB, double strand break）。這種DNA的損傷可以啟動細胞內的修復機制，主要包括兩種途徑：
一是低保真性的非同源末端連接途徑（NHEJ，Non-homologous end joining），此修復機制非常容易發生錯誤，導致修復後發生鹼基的缺失或插入（Indel），從而造成移碼突變，最終達到基因敲除的目的。NHEJ是細胞內主要的DNA斷裂損傷修復機制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的實現移碼突變，從而制備基因敲除模式動物。CRISPR/Cas9技術的出現，使得無需再使用相應物種的ES細胞系就可以制備基因敲除模式生物，且已成功應用於小鼠[5]、大鼠[6]、豬[7]、靈長類[8]、果蠅[9]等等。
第二種DNA斷裂修復途徑為同源介導的修復（HR, homology-directedrepair），這種基於同源重組的修復機制保真性高，但是發生概率低。在提供外源修復模板的情況下，靶向核酸酶對DNA的切割可以將同源重組發生的概率提高約1000倍[10]。利用這種機制可以實現基因組的精確編輯，如：條件性基因敲除、基因敲進、基因替換、點突變等等。
CRISPR/Cas9技術以自己操作的便捷性，高效的基因編輯能力獲得青睞，成為當下科研工作者的新寵兒。各大實驗室紛紛加入開發CARISPR/Cas9技術的行列中，媒體也將之評為21世紀最有影響的十大技術之一。讓我們跟隨CRISPR/Cas9技術的腳步一起加強科研基礎的建設，推動生物科研的進步！
詳細信息你可以參考：http://www.bbctg.com.cn/show_2/1733.html
8. crispr-cas怎麼導致基因改變
4月15日，隸屬於麻省理工學院和哈佛大學的世界著名生物醫學研究機構Broad研究所宣布，美國專利局批准了由他們所申請的基於CRISPR-Cas9系統的基因編輯技術專利。這是目前世界第一例獲得專利保護的基於CRISPR-Cas9系統的基因編輯技術。
正在生物體內發揮功能的CRISPR-Cas9系統。插畫家：Stephen Dixon
所謂基因編輯技術，是指對DNA核苷酸序列進行刪除和插入等操作，換句話說，基因編輯技術使得人們可以依靠自己的意願改寫DNA這本由脫氧核苷酸寫而成的生命之書。然而長期以來，對DNA的編輯只能通過物理和化學誘變、同源重組等方式來對DNA進行編輯。然而這些方法要麼編輯位置隨機，要麼需要花費大量人力物力進行操作。因此，能夠方便而精確的對DNA和核苷酸序列進行編輯，是科研工作者們長期以來的夢想。CRISPR-Cas9系統的誕生和成熟標志這這一夢想逐漸變為現實。此外不僅僅在科研界，在諸如醫療、農業、畜牧業等研究中，這一技術也顯現除了巨大的應用前景。因此，這一技術獲得專利，是該技術走向應用的里程碑式事件。
從細菌免疫系統到DNA編輯工具
CRISPR-Cas9系統並非天生就是為人類使用而產生的。它的本質其實是細菌中一種對付諸如病毒等外來DNA的防禦系統。在一些細菌基因組中存在一系列成簇排列的DNA序列，被稱作「規律間隔成簇短迴文重復序列」（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）。這些重復序列的間隔序列，被發現和很多能夠侵入細菌的噬菌體DNA序列相同。進一步研究發現，這些序列在被轉錄成為RNA後，能夠和細菌產生的一類稱為Cas的蛋白質形成復合體，來對Cas蛋白起到導向作用，因此這段RNA也被稱為導向RNA（guide RNA，gRNA）。當復合體檢測到入侵的DNA和gRNA序列一致時，Cas蛋白就能夠切割入侵的DNA，達到防禦的目的。
註：嚴格來說，在細菌體內gRNA由兩部分組成：一部分為活化Cas蛋白所需的tracrRNA，另一部分為來自於間隔區、識別入侵DNA的crRNA。在人工構建的CRISPR-Cas9系統載體中，這兩段RNA可融合為一條。
CRISPR-Cas系統這種序列特異性的DNA切割機制很快引起了人們的興趣。由於這一系統能夠切割DNA，並且其序列特異性由crRNA的序列所決定，因此它成為了DNA編輯的理想工具。細菌中的CRISPR-Cas系統極為多樣，而一個來自產膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的由Cas9蛋白參與的系統被人們研究的最為透徹。因此人們對它進行了改造，將編碼Cas9蛋白的序列及其附屬元件共同製造成為一個單一的載體。同時為了能夠讓這些組分進入真核細胞的細胞核，還加入了入核信號元件。這樣一來，只要科研人員只需針對需要編輯的DNA序列合成一段DNA序列，插入這個載體的特定部位。在轉入宿主細胞後，產生的人工構建的gRNA就能指導Cas9蛋白切割宿主細胞特定的DNA序列，從而起到基因編輯的作用。
CRISPR-Cas9基因編輯系統示意。圖片來源：《生物化學與生物物理進展》
DNA編輯的廣泛前景
CRISPR-Cas9系統，被稱為第三代基因編輯技術。相比於它的兩位前輩ZFN系統和TALEN系統，它有著一些無可比擬的優點。首先，CRISPR-Cas9系統的可用位置更多。理論上基因組中每8個鹼基就能找到一個可以用CRISPR-Cas9進行編輯的位置，可以說這一技術能對任一基因進行操作，而TALEN和ZFN系統則在數百甚至上千個鹼基中才能找到一個可用位點，這大大限制了使用范圍。其次，CRISPR-Cas9系統更具有可拓展性，例如可以通過對Cas9蛋白的修飾，讓它不切斷DNA雙鏈，而只是切開單鏈，這樣可以大大降低切開雙鏈後帶來的非同源末端連接造成的染色體變異風險。此外還可以將Cas9蛋白連接其他功能蛋白，來在特定DNA序列上研究這些蛋白對細胞的影響。第三，更為重要的是，CRISPR-Cas9系統的使用極為方便，只需要簡單的幾步就能完成，幾乎任何實驗室都可以開展工作，而不需要向ZFN和TALEN那樣藉助商業公司的協助完成。由於以上特點，CRISPR-Cas9被評為2013年生物學10大突破之一。值得說明的是，CRISPR-Cas9系統在真核細胞中很多重要的研究，都是由華人學者張峰主持完成的。
由於來源於細菌的CRISPR-Cas9系統在真核細胞內也能很好的工作，這顯示出了其巨大的應用潛力。例如在基礎科學研究領域，CRISPR-Cas9系統最多的是被用來定點敲除一些基因，從而便於研究這些基因的生物學功能。同時CRISPR-Cas9系統的商業化應用潛力也不容小視。例如在生物治療領域，結合誘導多能幹細胞（iPS）技術，人們可以將通過基因編輯修復的iPS細胞重新發育為正常組織和器官來供病人使用。而在家畜育種等工作中，對一些關鍵性狀基因的編輯能夠大大加快良種的育種速度。
正是由於CRISPR-Cas9的諸多優秀特點和廣泛的應用前景，因此它成為了專利申請的熱門方面。盡管已經有多份應用CRISPR序列或Cas蛋白的技術專利，但這次Broad研究所獲得批準的是第一份將一整套CRISPR-Cas9系統載體和操作方法包括在內的專利。這意味著今後使用這一技術進行基因編輯操作都將涉及這份專利所保護的內容。那麼，專利的批準是否會妨礙這一技術的使用呢？目前來看，基礎研究受到影響的可能性不大，因為Broad研究院的主任埃里克·蘭德（Eric Lander）在專利宣布的新聞稿中表示：「考慮到Broad研究所的使命是為了加速我們對於疾病的理解和治療，因此我們承諾授權給全球的研究團隊使用這種技術的權利。」但是，在更有利可圖的商業化應用領域，這一專利的出現是否會對使用該技術的企業造成影響還有待觀察，畢竟Broad研究所在上述表態之外還有一句：「享有這一專利的限制權」