什麼是激光顯微切割

㈠ 激光顯微細胞分離技術原理和流程

在基礎醫學研究中涉及越來越多的如某一疾病狀態組織中，多種基因或遺傳變化，區別發展中的組織細胞群以及疾病狀態組織細胞，將有助於了解疾病發生的分子機制。因此，在下一代的分子分析方法將需要進入微觀世界及自動化程度高。對
某一特殊個體的切片進行遺傳指紋圖譜鑒定，將有助於診斷及指導治療。

然而，即使是最經典、可靠的檢測方法，也不可避免混雜多種狀態細胞中DNA、RNA或蛋白質分子的干擾，因此，需要發展組織顯微分離技術，以解決從混合細胞型組織中分離某單一群的細胞。最開始，研究者從冰凍的組織塊中粗略地挖取富含某一類細胞類群的組織，或用激光破壞手工墨水標記的不需要部分，或手工工具針或刀機械地去除或刮取相應的組織。上述幾種方法在操作過程中繁瑣，不夠精確，效率不能適應常規的臨床分子診斷方法。為了解決上述問題，美國國立健康研究院腫瘤研究所病理研究室與生物醫學設備組合作研發激光俘獲顯微切割技術，發展為Acturus 的PixCell II系統。在操作這套系統時，首先在組織切片上覆蓋一層透明的膜，在顯微鏡下觀察該組織切片，選擇某一特殊細胞後，開啟脈沖式紅外激光束，使膜融化變得粘性很強(該膜的成份為 Ethylene Vinyl Acetate Polymer)，等到冷卻後將該位置的細胞牢固地粘附在上面從而分離細胞。

該種方法較以往方法改進之處：首先，它簡單，不需要移動任何切片部位，一步即可完成從組織中分離特殊細胞，這些在膜上的細胞依然保持其原有的形態，使用無菌、一次性的膜可最大限度地避免可能的污染。這對於後續進行PCR檢測是尤為重要的。其次，使膜活化所需的激光能量很小(<50mW)，與常規顯微配合是充足的，完全能夠滿足臨床病理組織細胞顯微分離的需要。再者，LCM技術分離細胞速度較以往方法有很大提高，例如，從腎組織切片中分離一個腎小球(Glomerulus)所需時間小於10秒，一小時內即可輕松地分離上百個腎小球。手工分離方法遠遠不能達到該速度。由於組織切片固定，操作者可以反過來確定所分離的細胞是正確的靶細胞。而手工機械顯微分離可能會引起周圍其它細胞一塊松動，污染靶細胞。

一個新技術及伴隨新技術誕生的儀器會對科學研究產生重要的影響。在NATURE MEDICINE • VOLUME 5 • NUMBER 1:117-112 • JANUARY 1999 的研究論文中，作者將 LCM、 RNA擴增和基因晶元三種技術整合到分子神經生物學研究中.研究涉及一個神經組織：背根神經節(DRG).DRG位於脊髓兩邊,很小,大鼠的DRG只有1/3大米粒大.腦內和DRG有類似功能的組織是三叉神經節.DRG中有兩類神經元:大神經元和小神經元.

國內科學家曾利用DD-PCR技術研究正常大鼠和接受傷害性刺激的大鼠的DRG的基因表達差異，篩選參與傷害性刺激相關基因,包括新基因和已知基因的新功能.目前認為DRG中與傷害性刺激有關的神經元是小神經元.研究者可能的苦惱是不能分別取出DRG中的大小神經元來進行研究。另一個苦惱是由於DRG很小, 所以為了提取足夠使用的RNA,不得不殺大量大鼠,有時一次就殺上百隻。而且從大鼠取DRG也不是一件很容易的解剖技術.還有一個苦惱就是DD-PCR要接觸同位素,即在進行DD-PCR反應時加入同位素標記的dATP或dCTP，這樣得到的PCR產物就標記上了同位素.產物進行PAGE,電泳後干膠儀器干膠.干膠曝X光片, 曝光後的X光片和膠對好位置,從膠中回收感興趣的DNA片段。鑒於這些苦惱，研究者們可能希望:要是能把大小神經元分開該多好,要是能把RNA擴增該多好,要是做DD-PCR時能不用同位素該多好.如今看來,這些難題似乎可以迎刃而解了。即利用LCM技術取出感興趣的細胞,利用Epicentre Ampliscribe T7 Transcription Kit把有限量組織中提出的有限量RNA擴增;進行DD-PCR反應時用紅外熒光染料標記(的引物)技術取代同位素標記技術,經Odyssey Infrared Imaging System檢測和定位,從而可以從膠中回收希望回收的片段。這個回收方案同樣可以用於AFLP研究者回收他們感興趣的DNA片段。

當前,在生命科學領域,和基因組學及蛋白組學一樣熱門的是神經科學,而且神經科學在國內外都正在成為最具挑戰性和最具誘惑力的科學。因此,在國內外從事神經科學研究的科技工作者越來越多,國家對神經科學的資助也越來越大。神經系統由外周神經系統和中樞神經系統組成,中樞神經系統包括腦和脊髓.神經系統主要由兩類細胞組成：神經元和膠質細胞.在腦內,不同解剖區域行使不同功能,這里所講的解剖區域是指核團。核團在顯微鏡下才可以辨別,是相對集中在一個區域的可能行使一定功能的神經元和膠質細胞的集合體。把某個核團從腦內取出來是不太現實的。腦內核團數以百計,如果要想研究基因在腦內核團的表達水平, 在以前只能用原位雜交技術。如果要想研究蛋白質的表達水平或磷酸化等狀態，只能用免疫組織化學技術。而這兩個技術雖然能精確定位基因或蛋白質在腦內核團的表達情況,缺點是通量小。因此，如果研究者主要是為了研究很多種基因在特定核團的神經元或膠質細胞的表達情況,新的解決方案之一就是組合LCM技術、RNA擴增技術和基因晶元技術。即利用LCM技術將特定核團的神經元或膠質細胞取出,提取總RNA或mRNA,RNA反轉錄為cDNA並進行擴增.最後將cDNA標記為探針,和基因晶元雜交。如果研究的基因種類數不多,那麼也可以只提取LCM獲得的細胞的總RNA,利用定量RT-PCR技術來進行基因表達分析。

㈡ 有誰知道廣州哪些大學可以做激光捕獲顯微切割

中山醫附一院

㈢ 什麼是激光顯微切割技術

顯微切割（micro-desection）就是在顯微鏡下用手工或儀器采樣的方法從組織切片或細胞塗片上將所要研究的形態或表型相同的細胞從組織三維構造中分離出來，獲得純的細胞群（pure cell population），以備進一步作分子水平的研究。顯微切割技術的貢獻就是克服了組織的細胞成分非常繁雜這一重大的缺點。
一、顯微切割的方法
1．材料來源
微切割可用於福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片、冰凍切片、培養細胞和細胞塗片。但所用載玻片不準塗抹任何粘附劑，常用的組織切片是HE染色的常規石蠟切片（厚5μm）。
2．切割及細胞採集方法
微切割及細胞採集方法大體上可分為手工操作和儀器操作兩大類。兩者各有長短。從兩個方面評價這些方法，一是准確性，即有無雜細胞污染；二是它的效率，能否在較短時間內採集到足夠的細胞；當然也要考慮方法所需費用。
（1）手工操作 就是用消毒的細針或刀片搔刮組織切片（厚5~15μm）上的細胞，並將其移至Eppendorf管中。
（2）儀器操作 利用激光進行微切割和細胞採集，其特點是微切割的精度高，可進行單個或幾個至數十個細胞的切割，可獲得很純的細胞群體，並適用於各種組織材料；再就是效率高，但儀器價格昂貴。具體又有4種不同的方法：①激光微光束微切割 ② 激光加壓彈射 ③貼於膜上的原組織微切割 ④激光俘獲微切割。
二、顯微切割的應用
1．細胞基因突變及微衛星變異的研究
2．細胞基因拷貝數的變化和甲基化水平的檢測
3．定量RT-PCR
4．比較基因組雜交
5．cDNA微陣列（晶元）
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㈣ 激光捕獲顯微切割 獲得的單細胞可以用來測序嗎

首先你需要一台抄能夠真正獲取到單細胞的激光顯微切割系統。該系統必須能夠很好的獲得單細胞，同時不能破壞細胞活性。推薦德國的MMI
後期單細胞測序時，需要獲取多個單細胞才具有實際意義。通常需要100-1000個左右的單細胞進行測序。
基因公司可以提供單細胞測序的所有技術支持。