如何設計Cas13a切割位點

㈠ 如何設計我的CRISPR/Cas實驗

十年前，當研究人員開始解析細菌和古細菌中一個稱為 CRISPR 結構的時候，他們並沒有預料到這會給基因編輯世界帶來一場風暴。在過去的這一年半時間里，CRISPR 方法已迅速席捲了整個動物王國，成為 DNA 突變和編輯的一種「馬上」技術——迄今為止在幾乎每種實驗細胞類型中都能起作用，包括人類細胞，小鼠，斑馬魚和果蠅細胞；這種技術也易於操作，已經有兩個研究組利用 CRISPR 分析了人類細胞中幾乎每個基因單突變（詳細報道 Science：CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：張峰建立CRISPR/Cas9人細胞敲除體系）。就在最近，CRISPR 還幫助研究人員完成了攜帶特殊基因中斷（gene disruptions）的工程猴，這項壯舉此前曾在小鼠中實現過，但未在靈長類動物中完成過（詳細報道 Cell：中國科學家利用CRISPR/Cas9技術構建基因工程猴）。

CRISPR 本身是一種防禦系統，用以保護細菌和古細菌細胞不受病毒的侵害。在這些生物基因組中的 CRISPR 位點能表達與入侵病毒基因組序列相匹配的小分子 RNA。當微生物感染了這些病毒中的一種，CRISPR RNA 就能通過互補序列結合病毒基因組，並表達 CRISPR 相關酶，也就是 Cas，這些酶都是核酸酶，能切割病毒 DNA，阻止病毒完成其功能。

將 CRISPR/Cas 系統用於其它非細菌細胞需要滿足兩個條件：一個 Cas 酶，用於切斷靶標 DNA，比如目的基因中的 DNA 片段，另外一個就是稱為導向 RNA （gRNA）的 RNA 分子，這種分子能通過互補結合靶標。gRNA 也就是細菌細胞中 CRISPR RNA 的一個更短的版本，它能與 Cas 形成復合物，指導 Cas 到達正確的剪切位點。不過研究人員也可以通過結合其它元件，或者改變 Cas 活性，來調整這種工具在基因校正和基因調控方面的作用。

「目前，非傳統基因編輯應用方面的生物學家利用一種新工具，分析細胞中，和整個生物機體中突變的作用」，來自加州大學伯克利分校的生物化學教授Jennifer Doudna 表示，她與她的同事解析了細菌細胞中 CRISPR 的作用機制。近期，Doudna 研究組利用這種工具，首次通過小鼠受精卵基因編輯構建了敲除小鼠。

不過 CRISPR 技術也存在一個主要的缺點，那就是缺乏特異性：一些 gRNA 分子結合的 DNA 只是部分與 gRN 互補。在這一方面，其它基因編輯方法，如鋅指核酸酶（ZFN）和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更為具有優勢，因為這兩者需要識別更長的靶標 DNA 序列。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和細胞表達方面要比 gRNA 難得多，而且研究人員通常還需要驗證十幾個不同的 TALENS，以及幾十個不同的 ZFNs，來證明其中一個有效。

近期《科學家》（The Scientist）雜志匯總了基因編輯過程中 Cas 和 gRNA 的處理過程及解決方案，用於幫助新接觸這一技術的研究人員熟悉這項熱門技術。

如何 CRISPR 我的靶標？
由於 CRISPR 系統並不復雜，因此我們所要做的就是將帶有質粒（能表達 Cas 和 gRNA）的細胞進行轉染。研究人員可以採用一種 Cas 的變體，即 Cas9，這種酶來自於一種鏈球菌，由 RNA 進行指引，能無需其他蛋白的幫助而切割 DNA （Science, 337:816-21, 2012）。Cas9 既能切斷與 gRNA 結合的 DNA 鏈，也能切斷其互補鏈。目前可以從 Addgene 購買 Cas9 質粒（65 美元），將其直接轉染入細胞。