色譜使用前採用什麼儀器

㈠ 液相色譜儀的使用步驟

目的：制定規范的高效液相色譜儀操作、維護保養和清潔規程。
范圍：適用於Agilent 1260 HPLC。
責任：色譜檢驗工程師負責本規程執行。
內容：
1 開機
1.1 打開電腦。
1.2 打開液相色譜各個模塊的電源。
1.3 雙擊桌面「儀器—聯機」，進入聯機界面。
1.4 排氣：
1.4.1 手動旋開泵處沖洗閥（逆時針旋轉約1圈）。
1.4.2 右鍵單擊「泵」圖標區域，選擇「方法…」選項，進入泵編輯畫面，設流速：5ml/min（一般為3－5ml/min），點擊「確定」。
1.4.3 右鍵單擊「泵」 圖標，點擊「控制…」選項，選中「ON」，點擊「確定」，則系統開始沖洗，直到管線內（由溶劑瓶到泵入口）無氣泡為止，（一般為5分鍾），切換通道繼續沖洗，直到所有要用通道無氣泡為止。
1.4.4 右鍵單擊「泵」 圖標，點擊「方法…」選項，設流速：0ml/min，手動旋緊沖洗閥。
1.4.5 右鍵單擊「泵」圖標，點擊「方法…」選項，按照方法要求選擇合適比例的流動相，設流速：1.0ml/min。
1.4.6 同理右鍵單擊「柱溫箱」，「檢測器」圖標，點擊「方法…」選項，按照方法的要求設置溫度，波長，點擊「控制」 選項，「ON」打開柱溫箱和檢測器。

2 編輯方法
2.1 點擊「方法」－「編輯完整方法」開始編輯完整方法。
2.2 選中除「數據分析 」外的三項，進入下一選項卡。
2.3 方法信息：在「方法注釋」中加入方法的信息（如：This is for test!）。進入下一選項卡。
2.4 泵參數設定：在「流速」處輸入流量, 如1.0ml/min，停止時間：如10 min（該停止時間僅為做一個樣品需要的時間），按照要求選擇合適比例的流動相配比，如乙腈：水＝75：25，A為水，B為乙腈，則設置B：75％即可。進入下一選項卡。
2.5 自動進樣器參數設定: 選擇「洗針進樣」----可以輸入進樣體積和洗瓶位置，進入下一選項卡。
2.6 柱溫箱參數設定: 在「溫度」下面的空白方框內輸入所需溫度,如：40度。進入下一選項卡。
2.7 UV檢測器參數設定: 在「波長」下方的空白處輸入所需的檢測波長,如254nm。點擊確定。
2.8 在「 運行時選項表 」中，選中「 數據採集」，點擊「確定」。
2.9 從「方法」菜單，選中「方法另存為…」，輸入一方法名，如「測試」，點擊「確定。

3 單次採集
3.1 從「運行控制」菜單中，選擇「樣品信息」選項，選擇合適的路徑，在「數據文件」中選擇 「前綴/計數器」，輸入樣品瓶的位置，點擊「確定」。
3.2 基線平穩後約10分鍾，從「運行控制」菜單中選擇「運行方法」。

4 多次數據採集
4.1 按照步驟2 編輯完整方法。
4.2 點擊「序列」－「序列表」，輸入「樣品瓶」「樣品名稱」，「進樣次數」，選擇合適的「做樣方法」
4.3 點擊「序列」－「序列參數」，選擇序列數據的保存路徑（序列會自動生成以「序列名稱－時間」為名稱的文件夾保存數據），數據建議以選擇 「前綴/計數器」保存。
4.4 從「序列」菜單，選中「序列另存為…」，輸入一序列名，如「測試」，點擊「確定。
4.5 從「運行控制」菜單中選擇「運行序列」。

5 數據分析（離線狀態使用）
5.1 雙擊「儀器 —離線」圖標 進入的離線畫面。
5.2 從「視圖」菜單中，點擊「數據分析」進入數據分析畫面。
5.3 從「文件」菜單選擇「調用信號」，選中您的數據文件名。點擊「 確定」，則數據被調出。（如預建立標准曲線，應先打開濃度較低的標樣圖譜。）
5.4 做譜圖優化：從「圖形」菜單中選擇「信號選項」。從「范圍」 中選擇「滿量程」 或「自動量程」 及合適的時間范圍或選擇「自定義量程」 調整。反復進行，直到圖的比例合適為止。點擊「 確定」。

6 積分:
6.1 從「積分」菜單中選擇「積分事件」選項，選擇合適的「斜率靈敏度」，「峰寬」，「最小峰面積」，「最小峰高」。點擊 ，自動載入積分參數。
6.2 點擊左邊「√」圖標，將積分參數存入方法並退出「積分事件」。
6.3 如積分結果不理想，則修改相應的積分參數，直到滿意為止。

7 標准曲線
7.1 點擊「校正」－「校正設置」，輸入「含量單位」。
7.2 點擊「校正」－「新建校正表」，點擊確定。輸入「化合物名稱」和「含量」，點擊「確定」，按照提示刪除其他組分。
7.3 至此完成單級校正，如要增加校正級別，應從「文件」菜單選擇「調用信號」，選中您的數據文件名（第二個標樣），點擊「校正」－「添加級別」，點擊確定，輸入「含量」，依次增加校正級別。

8 列印報告
8.1 從「報告」菜單中選擇「設定報告」選項，點擊「定量結果」框中「定量」右側的黑三角，選中「外標法」，其它選項不變，點擊「 確定」。
8.2 從「報告」菜單中選擇「列印報告」，則報告結果將列印到屏幕上，如想輸出到列印機上，則點擊「報告」 底部的「列印」鈕。
8.3 點擊「文件」－「另存為」－「方法」，把數據分析方法保存，下次分析可直接在「文件」－「調用」－「方法」下，將該方法調出使用。（調用的方法中含有積分方法，標准曲線方法和列印報告方法）

9 關機
9.1 關機前，先關紫外燈，用相應的溶劑（甲醇或乙腈）充分沖洗系統大約30分鍾。（色譜柱最終應保存在甲醇或乙腈中）
9.2 退出化學工作站，依提示關泵，及其它窗口，關閉計算機。
9.3 關閉Agilent 1260各模塊電源開關。

10 其它注意事項
10.1 當樣品運行時，切勿打開自動進樣器前遮蓋，否則進樣過程停止。
10.2 系統發生漏液時，機器會檢測到並停止進樣，狀態指示燈為紅色。檢查擦乾並安置好漏液處，擦乾漏液感測器，單擊ON按鈕，系統重新初始化。
10.3 注意紫外燈使用壽命，切勿來回開關紫外燈。

㈡ 常用的色譜儀器有哪兩大類，各自有何特點

色譜儀器分為氣相色譜和液相色譜，還有氣相色譜質譜聯用儀等；

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那麼，高效液相色譜儀（HPLC,）如何選型？

高效液相色譜儀的選型，歸結起來就是2個問題：如何確定高效液相色譜儀的配置？如何選擇高效液相色譜儀的品牌？

今天我們就來談談第一問題，如何確定高效液相色譜儀的配置？

高效液相色譜儀可以分為5大部分：高壓輸液泵單元、進樣器單元、分離單元、檢測器單元、色譜數據處理單元，下面我們來逐一分析，談談高效液相色譜儀的選型細則。

1、高壓輸液泵單元的配置選型：

高效液相色譜儀的高壓輸液方式分為等度方式、梯度方式兩大類別。

等度方式：在色譜分析過程中，流動相中各個組分的比例不隨時間發生變化，例如某次分析過程中流動相中甲醇與水的比例是50：50一直保持不變，那麼這種就叫做等度方式。

梯度方式：在色譜分析過程中，流動相中各個組分的比例隨時間發生發生變化，例如某次分析過程中，隨著時間的推移，流動相中其中一種（或幾種）溶劑比例逐漸增大、另一種或幾種溶劑的比例逐漸減少，最終那麼這種輸液方式就叫做梯度方式。

相應以上2種流動相輸液方式，有等度泵和梯度泵這兩種配置方式。

等度泵：一般採用單泵來作為高壓輸液泵單元，這是一種最簡單最經濟的配置方式。

梯度泵：又分為高壓梯度、低壓梯度。

高壓梯度：常用的是二元高壓梯度泵，也有三元高壓梯度泵；我們通常所說的雙泵，就是指「二元高壓梯度泵」。有幾元高壓，則必須有幾台泵；高壓梯度泵單元，除了幾台高壓泵之外，還需要有配套的流動相混合裝置（通常採用混合器）；由於是高壓混合的梯度方式，所以通常不太會產生氣泡，脫氣機通常可以不用配備。

低壓梯度：與高壓梯度「有幾元高壓就用幾台泵」所不同的是，低壓梯度只需要一台高壓泵，但是在高壓泵的前端，需要加上比例閥（有的公司稱為低壓梯度單元），通過比例閥來調節幾種不同流動相進入高壓泵的比例，從而實現梯度淋洗。因為低壓下各種不同溶劑混合時可能產生吸熱或放熱，所以對於低壓梯度泵單元來說，流動相脫氣機與混合器一樣，都是必不可少的。

高效液相色譜儀（HPLC）的高壓輸液泵單元的選型，主要是根據所檢測項目方法的所需來定，方法中流動相輸液是等度方式，那麼等度泵（單泵）即可滿足需求；如果方法中規定需要用到梯度淋洗輸液方式，那麼就需要選擇梯度泵了。

在一些有HPLC分析方法開發任務的單位，為了滿足將來可能的方法開發需要，即便暫時不需要梯度泵，也往往會配備梯度泵以利拓展方法。

2、進樣器單元的配置選型

高效液相色譜儀（HPLC）的進樣器單元，有2種配置可供選擇：手動進樣器、自動進樣器。

手動進樣器：無論是國產還是進口大牌，例如沃特世（Waters）、島津（Shimadzu）、安捷倫（Agilent），世界上絕大多數公司均採用美國Rheodyne公司生產的六通進樣閥作為高效液相色譜儀的手動進樣閥。

自動進樣器：自動進樣器的最大優點就是，能極大的提高設備使用效率、減少人力成本。例如一個公司的HPLC使用部門，可以在下午下班之前，把未做完的50個樣品都放進自動進樣器內，然後設定分析程序、儀器清洗程序、關機程序，然後所有的人都可以下班，無需派人值守，第二天早上列印圖譜、上報數據即可。

3、分離單元（高效液相色譜柱）

色譜柱是高效液相色譜儀的核心部件。

色譜法最核心的機制就是把樣品中各個組分進行有效分離，而實現分離靠的就是色譜柱。

色譜柱選擇時需要考慮四大參數：固定相類型（填料種類）、柱長、柱內徑、填料粒度。

固定相類型：目前主要有硅膠基質的ODS(碳十八)、氨基、氰基、苯基、硅膠等色譜柱，以及高分子聚合物的固定相填料。目前ODS(碳十八)應用最為廣泛，高效液相色譜法大約有80%分離採用的就是ODS(碳十八)填料。

柱長：色譜柱的長度越長，分離效果越好，但是背壓也就越大、柱子價格就會越貴。目前柱長應用較多的是375px、500px、625px這三個長度，尤其以625px最多。

柱內徑：其它幾個柱參數不變的情況下，高效液相色譜柱的內徑越小，分離度越好（分離度越高），但是柱負載量越小。常用柱內徑是3.9mm、4.6mm、6.0mm，尤其以4.6mm為最常用。

填料粒徑：根據色譜法的速率理論，填料粒徑越小，分離效果越好；但是填料粒度越小，在同樣的流動相輸送流速下，對於高效色譜儀高壓泵的背壓也就越大，對於高壓泵的加壓能力、密封性能也就要求越高。高效液相色譜儀一般採用3微米、5微米或10微米的填料粒徑，而3微米以下粒徑的填料，通常應用於超高效液相色譜儀。高效液相色譜法應用最多的是5微米粒徑的填料。

分離單元還有另外兩個問題需要掂量：是否需要配預柱（保護柱）、是否需要配柱溫箱。

預柱（保護柱）：預柱（保護柱）的存在，會加大色譜死體積，會降低柱效，所以除非樣品特別臟、或有特別多的高分子物質會堵塞分析柱，否則盡量不用預柱（保護柱）。

柱溫箱：因為高效液相色譜法對於溫度的些微波動並不特別敏感，除了一些對於柱溫穩定性要求特別高的分離，高效液相色譜法很多情況下並不需要配置柱溫箱。當然，如果采購預算足夠多，安裝柱溫箱確實能有更好的色譜出峰時間重復性。

4、檢測器單元的配置選型

高效液相色譜儀的檢測器有很多種，最常見的是紫外檢測器，還有示差檢測器、熒光檢測器、二極體陣列檢測器、蒸發光散射檢測器等等。

紫外檢測器：是一種選擇性檢測器，幾乎是所有HPLC檢測器裡面價格最便宜、應用最廣泛的一種檢測器，適合於測定有紫外吸收的物質（帶苯環、雜環、雙鍵叄鍵的物質）。紫外檢測器的特點是靈敏度很高、適用性很廣泛。

示差檢測器：是一種通用型檢測器，但是它的靈敏度低於紫外檢測器，而且它對於流速比較敏感。示差檢測器主要用來對一些沒有紫外吸收的物質進行檢測，例如糖類、高分子聚合物等等。

熒光檢測器：僅僅適合於在紫外光照射下能發射熒光的物質，例如維生素A、維生素D、黃麴黴毒素等檢測。高效液相色譜儀的熒光檢測器的特點是靈敏度高、但適用范圍較窄。

二極體陣列檢測器：是紫外檢測器的一個變種，二極體陣列檢測器的特點是靈敏度較紫外檢測器低、但是能做三維圖譜，特別適合於醫葯研發類的應用。

蒸發光散射檢測器：蒸發光散射檢測器是一種新型的通用型檢測器，未來的趨勢是可以替代示差檢測器等來檢測無紫外吸收的物質，但是目前價格非常昂貴。

5、色譜數據處理單元

高效液相色譜儀的色譜數據處理單元，有數據處理機和色譜工作站兩種，隨著電腦的普及與應用，色譜數據處理機已經漸漸被淘汰，目前以色譜工作站為主流。

色譜工作站又分為可否反控兩大類。

可反控工作站：不但能記錄與處理色譜數據，而且可以反控高效液相色譜儀的各個組成單元。因為一些控制指令介面與數據傳輸的技術性問題，可反控工作站一般是各大儀器廠商自行研發與設計的，互相之間不能通用。

不可反控工作站：僅能記錄與處理色譜數據，不可反控高效液相色譜儀。不可反控工作站通常是外掛式的，包含硬體和軟體兩大部分，硬體部分主要是一個A/D轉換器，將高效液相色譜儀傳輸來的模擬信號轉換成數字信號，再輸進計算機；軟體部分主要功能就是把硬體傳輸來的數字信號轉換成圖譜並進行積分計算等操作。

不可反控工作站的優點是通用性強，但是不可反控儀器、不便進行自動化操作。

二極體陣列檢測器必須要用特殊的三維色譜軟體。

綜上所述，搞清楚了高效液相色譜儀的高壓輸液泵單元、進樣器單元、分離單元、檢測器單元、色譜數據處理單元的選型考量細則，那麼我們才可以在盡量節約經費的情況下，選到我們所需要的儀器配置了。

㈢ 同一根色譜柱，在不同的色譜儀器上，採用相同的色譜條件，但是雜質的分離度差異太大，比如A和B兩種物質

如果其他條件完全相同，也就是你所說的死體積的問題。管路上都差不多，主要是回檢測池的問題。如果儀器答1檢測池較小，進樣量比較小的話，會有你說的完全分離的情況。而換成了儀器2，檢測池較大，會出現樣品分散的情況，導致分不開。

㈣ 採用色譜法原理的分析儀器有哪些

高效液相色譜，氣相色譜，凝膠滲透色譜，氣質聯用，液質聯用等

㈤ 液相色譜儀使用步驟

高效液相色譜儀的使用

1.色譜柱它包括空柱和填料。空柱是內壁拋光的不銹鋼管，內徑為4～5mm，長100～250mm。按氣相色譜法中洗滌空柱的方法洗凈，用勻漿法填充固定相。將此柱裝入儀器的管路中，用柱式機械往復泵輸入新鮮脫氣的流動相。等基線平直後可用苯、萘、菲的混合試液，用正己烷(含 0.05%甲醇)或甲醇：水(83：17)為流動相測定柱效及分離度塔板數在2～3萬/ml以上及分離度在1.5以上者，柱效好。為防止柱污染，常用1個 50mm長，4~5mm內徑，裝有硅膠(40-50mm)或立柱相同填料的保護柱(預柱)接在主柱之前，以延長色譜柱的壽命。反相鍵合相柱用畢。必須用水充分流經，以洗去鹽類、酸鹼等雜質防止柱生銹及填料中雜質的積聚，再用甲醇流經洗滌使色譜柱獲得再生。

2.流動相的洗脫方式配好經脫氣的流動相放於貯液瓶中，經過有濾過頭、內徑2mm的聚四氟乙烯管流入高壓泵進入色譜柱，最後自檢測器流出或收集或作廢液回收。用流動相洗脫的方式有恆溶劑脫洗法(isocratic dlution)，即自洗脫開始到結束，溶劑的配比恆定。另一類為梯度洗脫法(gradicnt clution),即使溶劑的極性強度在色譜過程中逐漸增加。須按一定程序不斷改變流動相的濃度配比，從而使同一個試樣中組分性質相差較小的及較大的都能在一次色譜過程中很好分離，而整個色譜過程縮短。必須注意，梯度洗脫法不能用於分子排阻色譜及用電化學檢測的反相高效液相色譜法中。

3.檢測器適用於血葯濃度的檢測器有紫外線吸收，熒光發射和電化學三種。紫外檢測器應用於對紫外光有吸收的葯物，大多數葯物分子對紫外光有吸收，故能較普遍採用，檢測限有0.1μg左右。紫外檢測器有固定波長型、可變波長型及掃描器，既能使流動相停流作組分的定性定量檢測，又能提高測定靈敏度，重現性較好。熒光發射檢測器對能產生熒光的葯物才能使用。80年代應用激光替代氙燈光源，光強度增加了3~4倍，對某些葯物的檢測限可達pg級。電化學檢測器是由一個碳糊或破碳做成的蒲層電解池。常用於檢測兒茶酚胺類及有酚類基團的各種葯物和代謝物。流出組分進入2μl的薄層電解池，在一暄電壓下電解產生電流，放大後檢測，檢測限pg級。

4.數據處理現代高效液相色譜儀帶有數據處理系統，除記錄譜外，還能自動記錄峰的保留時間，能自動積分求算峰面積，並能按照預定的程序作有關計算，報告分析結果。

高效液相色譜儀使用過程中常見問題及其解決方法

1 液相色譜儀系統

液相色譜儀主要由貯液瓶、泵、進樣器、柱、柱溫箱、檢測器、數據處理系統組成(如圖1所示)。對於整個系統而言，柱子、泵和檢測器是核心部件，同時也是容易出事故的主要場所。

2 常見問題及解決方法

2.1 針對柱壓問題(表1)

柱壓問題是使用高效液相色譜過程中需要密切注意的地方，柱壓的穩定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時間等密切相關。所謂柱壓穩定並不是指壓力值穩定於一個恆定值，而是指壓力波動范圍在50PSI之間。壓力過高、過低及波動較大都屬於柱壓問題，但柱壓的高低與色譜柱的種類、品牌、液相系統本身及使用的流動相種類相聯系。值得注意的是在使用梯度洗脫時，進柱壓的平穩緩慢的變化是允許的。

在實際應用中柱壓過高可從以下幾個方面來考慮[1]。首先考慮柱子是否被堵，此時可更換一根新柱子進行檢測。

2.2 針對保留時間漂移的問題 [2，3] (表2)

保留時間的改變是很多液相色譜使用者常碰到的問題，其包括了保留時間增大和減小。它的產生與很多原因有關。

2.3 針對異常色譜峰問題[2-4]

異常的色譜峰指的是色譜圖中無峰或出現負峰、寬峰、雙峰、肩峰、峰形不對稱等情況。具體情況與原因分析如表3。

3 高效液相色譜儀的保養[5-7]

3.1 HPLC的日常操作條件

工作溫度10～30℃; 相對濕度<80%; 最好是恆溫、恆濕，遠離高電干擾、高振動設備。

3.2 泵的保養

使用流動相盡量要清潔;進液處的沙芯過濾頭要經常清洗;流動相交換時要防止沉澱;避免泵內堵塞或有氣泡。

3.3 進樣器的保養

每次分析結束後，要反復沖洗進樣口，防止樣品的交叉污染。

3.4 柱的保養

柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動;當柱子和色譜儀連接時，閥件或管路一定要清洗干凈;要注意流動相的脫氣; 避免使用高粘度的溶劑作為流動相;進樣樣品要提純;嚴格控制進樣量;每天分析工作結束後，要清洗進樣閥中殘留的樣品;每天分析測定結束後，都要用適當的溶劑來清洗柱;若分析柱長期不使用，應用適當有機溶劑保存並封閉。

3.5 檢測器(UV)的保養

紫外燈的保養要在分析前、柱平衡得差不多時，打開檢測器;在分析完成後，馬上關閉檢測器。同時樣品池要保養。

4 結語

在高效液相色譜使用過程中故障排出時要遵守以下原則：一次只改變一個因素，從而確定假定因素與問題之間的聯系;如果通過更換組件來排查故障時要注意將拆下的完好組件裝回原位，從而避免浪費;養成良好的記錄習慣，一個良好的記錄是成功地進行故障排除的關鍵。

總之，在使用高效液相色譜時一定要注意樣品的前處理與儀器的正確操作和保養，儀器系統的干凈是用好儀器和維護維修儀器的關鍵。

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㈥ 液相色譜儀使用及工作原理。

液相色譜儀是利用混合物在液-固或不互溶的兩種液體之間分配比的差異，對混專合物進行先分離，而後分屬析鑒定的儀器。廣泛應用到生物化學、食品分析、醫葯研究、環境分析、無機分析等各種領域。高效液相色譜儀與結構儀器的聯用是一個重要的發展方向。

液相色譜儀工作原理：統由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中液相色譜儀的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱（固定相）內，由於樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中作相對運動時，經過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式列印出來高效液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統，下面將分別敘述其各自的組成與特點。

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