cas9蛋白切割位点位于哪里

㈠ 胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，弹性蛋白酶，各自作用于蛋白水解的位点是什么为什么

胰蛋白酶在精氨酸和脯氨酸之后切割，胰凝乳蛋白酶在芳香族氨基酸位点后切割，弹性蛋白酶还不知道。

㈡ EK酶为什么切到Arg位点了啊

肠激酶是一种特抄异性蛋白酶，其识别序列为天冬氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸－赖氨酸，切割位点位于赖氨酸之后。有时因蛋白质底物构象的变化，肠激酶可能在其他碱性氨基酸残基处发生切割。
你的蛋白是不是复性过，可能是复性不正确导致构象改变，从而酶切位点异常。

㈢ 如何用IEDB预测蛋白激酶的剪切位点，比如预测CⅡ蛋白质的蛋白激酶剪切位点

构成SP及CAA的主要成分是由APP剪切而来的分子质量约为4ku的多肽，因其呈β蛋白激酶C（PKC）〔19〕激活时可以使APPs的释放增加，βA的生成减少．但

㈣ crispr/cas9的原理

此系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。
作为一种 RNA 导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响 Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及 RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。

㈤ 植物的遗传密码可不可以修改

植物的遗传密码是可以修改的。

“基因敲除”就是植物密码修改的技术之一，它是指将一定的基回因答从基因组中删除。在植物中，敲除某个基因后会产生外表形状的变化，通过表型可以分析某个基因与某种性状或功能是否有关系。同时，基因敲除也为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。

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基因敲除原理

gRNA识别并结合在目标基因区域引导Cas9蛋白对结合位点进行切割，引起DNA双链断裂（DSB），触发细胞自身的非同源末端修复机制（NHEJ），NHEJ修复的过程中往往会产生DNA的插入或删除（Indel），造成移码突变，致使基因功能丧失，从而实现基因敲除。

㈥ crispr基因点突变是怎么做

十年前，当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为 CRISPR 结构的时候，他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。在过去的这一年半时间里，CRISPR 方法已迅速席卷了整个动物王国，成为 DNA 突变和编辑的一种“马上”技术——迄今为止在几乎每种实验细胞类型中都能起作用，包括人类细胞，小鼠，斑马鱼和果蝇细胞；这种技术也易于操作，已经有两个研究组利用 CRISPR 分析了人类细胞中几乎每个基因单突变（详细报道 Science：CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：张峰建立CRISPR/Cas9人细胞敲除体系）。就在最近，CRISPR 还帮助研究人员完成了携带特殊基因中断（gene disruptions）的工程猴，这项壮举此前曾在小鼠中实现过，但未在灵长类动物中完成过（详细报道 Cell：中国科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴）。

CRISPR 本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的 CRISPR 位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子 RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA 就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达 CRISPR 相关酶，也就是 Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒 DNA，阻止病毒完成其功能。

将 CRISPR/Cas 系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：一个 Cas 酶，用于切断靶标 DNA，比如目的基因中的 DNA 片段，另外一个就是称为导向 RNA （gRNA）的 RNA 分子，这种分子能通过互补结合靶标。gRNA 也就是细菌细胞中 CRISPR RNA 的一个更短的版本，它能与 Cas 形成复合物，指导 Cas 到达正确的剪切位点。不过研究人员也可以通过结合其它元件，或者改变 Cas 活性，来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。

“目前，非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具，分析细胞中，和整个生物机体中突变的作用”，来自加州大学伯克利分校的生物化学教授Jennifer Doudna 表示，她与她的同事解析了细菌细胞中 CRISPR 的作用机制。近期，Doudna 研究组利用这种工具，首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。

不过 CRISPR 技术也存在一个主要的缺点，那就是缺乏特异性：一些 gRNA 分子结合的 DNA 只是部分与 gRN 互补。在这一方面，其它基因编辑方法，如锌指核酸酶（ZFN）和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更为具有优势，因为这两者需要识别更长的靶标 DNA 序列。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和细胞表达方面要比 gRNA 难得多，而且研究人员通常还需要验证十几个不同的 TALENS，以及几十个不同的 ZFNs，来证明其中一个有效。

近期《科学家》（The Scientist）杂志汇总了基因编辑过程中 Cas 和 gRNA 的处理过程及解决方案，用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。

如何 CRISPR 我的靶标？
由于 CRISPR 系统并不复杂，因此我们所要做的就是将带有质粒（能表达 Cas 和 gRNA）的细胞进行转染。研究人员可以采用一种 Cas 的变体，即 Cas9，这种酶来自于一种链球菌，由 RNA 进行指引，能无需其他蛋白的帮助而切割 DNA （Science, 337:816-21, 2012）。Cas9 既能切断与 gRNA 结合的 DNA 链，也能切断其互补链。目前可以从 Addgene 购买 Cas9 质粒（65 美元），将其直接转染入细胞。

㈦ crispr/cas9到底是什么东西大家有关于这个的介绍和资料吗

最近几年基因编辑技术异常火爆，CRISPR/Cas9技术面世以后，弥补了传统基因编辑技术的诸多不足，使得基因的“任意编辑”变得越来越容易。也因此，CRISPR/Cas9技术当仁不让的成为基因编辑技术的“王牌”，大有一副取而代之的势头。所以这里就给大家简单介绍一下CRISPR/Cas9的技术原理！
一、CRISPR/Cas9系统的构成
CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。
Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
研究人员为了将CRISPR/Cas9技术发展为高效的基因打靶工具，又进行了优化和改造。Cong, L.等人[1]在不影响系统效率的情况下，将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。通过这种简化，CRISPR/Cas9系统现仅包括两个元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA）。因此现在人们将CRISPR/Cas9技术也称为Cas9/sgRNA技术。
二、CRISPR/Cas9技术的基因编辑机制
CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂（DSB, double strand break）。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：
一是低保真性的非同源末端连接途径（NHEJ，Non-homologous end joining），此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入（Indel），从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变，从而制备基因敲除模式动物。CRISPR/Cas9技术的出现，使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物，且已成功应用于小鼠[5]、大鼠[6]、猪[7]、灵长类[8]、果蝇[9]等等。
第二种DNA断裂修复途径为同源介导的修复（HR, homology-directedrepair），这种基于同源重组的修复机制保真性高，但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍[10]。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。
CRISPR/Cas9技术以自己操作的便捷性，高效的基因编辑能力获得青睐，成为当下科研工作者的新宠儿。各大实验室纷纷加入开发CARISPR/Cas9技术的行列中，媒体也将之评为21世纪最有影响的十大技术之一。让我们跟随CRISPR/Cas9技术的脚步一起加强科研基础的建设，推动生物科研的进步！

详细信息你可以参考：http://www.bbctg.com.cn/show_2/1733.html

㈧ smal限制酶切割位点

（1）质粒上含有两个SmaⅠ限制酶的切割位点，所以用SmaⅠ限制酶处理图甲所示的质粒会得到2个DNA片段；图乙所示的外源DNA含有一个AluⅠ限制酶的切割位点，所以用AluⅠ处理外源DNA会形成两个黏性末端，增加2个游离的磷酸基团．
（2）外源DNA含有四个酶切位点，即SmaⅠ、AluⅠ、PstⅠ和HindⅢ酶，其中AluⅠ酶的切割位点位于目的基因上，所以不能用此酶切割；用SmaⅠ酶切割会将质粒上两个标记基因均破坏，所以不能用SmaⅠ酶切割；应选用 PstⅠ和HindⅢ酶同时酶切质粒和含目的基因的外源DNA，这样可以避免目的基因和质粒在酶切后产生的片段发生自身环化或任意连接，也便于筛选需要．如果是用PCR技术扩增目的基因，设计引物是关键，但在扩增时退火温度一般为55～60℃，对于（A+T）%>50%，一般用55℃；（A+T）%≤50%时一般用60℃，原因是G与C之间是三个氢键，所以C和G比例越高，DNA越稳定．
（3）用 PstⅠ和HindⅢ酶同时酶切质粒，会破坏氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，所以导入重组质粒的大肠杆菌能抗四环素，但不能抗癌变青霉素．为了筛选获得含有重组质粒的大肠杆菌，首先将经转化处理过的大肠杆菌接种在含四环素的培养基中，然后用影印法将该培养基上的菌落按原来的方向印在含氯霉素培养基上，以筛选获得含重组质粒的细菌．在含四环素培养基中能生长繁殖，而在含氯霉素培养基中不能生长繁殖的是导入了重组质粒的大肠杆菌．
（4）因为大肠杆菌细胞内缺乏内质网与高尔基体，不能对多肽链进行折叠、组装与修饰，所以在上述导入了重组质粒的大肠杆菌菌株中，目的基因正常转录形成了mRNA，但其所控制合成的蛋白质却并不具有生物活性．
故答案为：
（1）22
（2）PstⅠ和HindⅢ酶G与C（之间是三个氢键）比例越高越稳定
（3）四环素氯霉素重组质粒（或目的基因）
（4）大肠杆菌细胞内缺乏内质网与高尔基体（或大肠杆菌缺乏生物膜系统），不能对多肽链进行折叠、组装与修饰

㈨ crispr系统中sgrna和grna一样吗

sgrna是single guide RNA（单导向RNA）的缩写。在CRISPR/Cas9系统中sgRNA与gRNA是一个概念。

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是原核生物基因组内的一段重复序列，是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务。

细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR-Cas9系统，利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的基因组上切除，这是细菌特有的免疫系统。

扩展知识：

功能特点：

CRISPR是生物科学领域的游戏规则改变者，这种突破性的技术通过一种名叫Cas9的特殊编程的酶发现、切除并取代DNA的特定部分。这种技术的影响极其深远，从改变老鼠皮毛的颜色到设计不传播疟疾的蚊子和抗虫害作物，再到修正镰状细胞性贫血等各类遗传疾病等等。

该技术具有非常精准、廉价、易于使用，并且非常强大的特点。

CRISPR来自微生物的免疫系统，这种工程编辑系统利用一种酶，能把一段作为引导工具的小RNA切入DNA，就能在此处切断或做其他改变。以往研究表明，通过这些介入，CRISPR能使基因组更有效地产生变化或突变，效率比TALEN（转录激活因子类感受器核酸酶）等其他基因编辑技术更高。

虽然CRISPR有许多优点，在人类癌细胞系列中，它也可能产生大量“误伤目标”，尤其是对不希望改变的基因做修改。

㈩ crispr/cas9的应用

基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。
2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。
CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。