cas9如何单链切割
1. crispr/cas9的原理
此系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。
作为一种 RNA 导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响 Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及 RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。
2. 为什么人类科技这么发达却无法攻克病毒
地球生命演化的两个极端，一个走向越来越复杂，比如我们人类，一个走向越来越简单，比如病毒。
埃博拉病毒，天花病毒、艾滋病病毒，甚至是最近已经在国外失控的新型冠状病毒，人类对病毒的恐惧比它们带来的危害更深。
我们的科技已经如此发达了，为什么我们还没法攻克病毒呢？我们总结了以下几点。
最后
随着人类科技的进步，我们肯定可以找到许多克制病毒的方法，但是，如果你知道抗生素启示录的话，你就一定知道，我们使用抗生素可能是在创造超级细菌，那CRISPR和其他方法呢？
病毒是地球最早的“居民”之一，比我们古老太多，而且并不是所有病毒都对人体有害，大多的病毒是对人体是有益的，它们与我们的进化息息相关，人类体内至少40—80%的基因来自病毒。
这两种进化的极端，这两个地球的“住人”，好像必然要一战，但我认为共存比攻克好许多！
3. 如何检测 crispr 基因敲除成功
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。
目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找 到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：
Cas9质粒构建
目前常见的CAS9普通质粒有（汉恒生物提供cas9质粒试剂盒）：
虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用质粒见addgene（lentiCRISPR v2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast），慢病毒可以整合入宿主基因组中，长期稳定的表达（汉恒生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包装），但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比较大（大于4kb），且长期插入可能导致乱切，脱靶等，同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因，腺病毒更有优势，腺病毒克隆能力强，获得的病毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说，作用是时间也比较长，可以达到更理想的敲除效果。
4. crispr/cas9技术敲除大片段只能切割双链吗
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5. 如何验证crisper cas9效果
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。
目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找 到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：
Cas9质粒构建
目前常见的CAS9普通质粒有（汉恒生物提供cas9质粒试剂盒）：
虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用质粒见addgene（lentiCRISPR v2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast），慢病毒可以整合入宿主基因组中，长期稳定的表达（汉恒生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包装），但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比较大（大于4kb），且长期插入可能导致乱切，脱靶等，同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因，腺病毒更有优势，腺病毒克隆能力强，获得的病毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说，作用是时间也比较长，可以达到更理想的敲除效果。
6. crispr-cas9 技术可用于大肠杆菌基因敲除吗
是的，确切来说是大量表达。
大肠杆菌是基因重组技术中常用的细菌，将外源目的内基因(如人胰岛容素基因)导入大肠杆菌后可在大肠杆菌内表达目的蛋白(如胰岛素)，由于细菌繁殖速度快，通过发酵便可在短时间内获得大量胰岛素，再经多步分离、纯化便得到了药用胰岛素。
7. crispr/cas9到底是什么东西大家有关于这个的介绍和资料吗
最近几年基因编辑技术异常火爆，CRISPR/Cas9技术面世以后，弥补了传统基因编辑技术的诸多不足，使得基因的“任意编辑”变得越来越容易。也因此，CRISPR/Cas9技术当仁不让的成为基因编辑技术的“王牌”，大有一副取而代之的势头。所以这里就给大家简单介绍一下CRISPR/Cas9的技术原理！
一、CRISPR/Cas9系统的构成
CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。
Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
研究人员为了将CRISPR/Cas9技术发展为高效的基因打靶工具，又进行了优化和改造。Cong, L.等人[1]在不影响系统效率的情况下，将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。通过这种简化，CRISPR/Cas9系统现仅包括两个元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA）。因此现在人们将CRISPR/Cas9技术也称为Cas9/sgRNA技术。
二、CRISPR/Cas9技术的基因编辑机制
CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂（DSB, double strand break）。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：
一是低保真性的非同源末端连接途径（NHEJ，Non-homologous end joining），此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入（Indel），从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变，从而制备基因敲除模式动物。CRISPR/Cas9技术的出现，使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物，且已成功应用于小鼠[5]、大鼠[6]、猪[7]、灵长类[8]、果蝇[9]等等。
第二种DNA断裂修复途径为同源介导的修复（HR, homology-directedrepair），这种基于同源重组的修复机制保真性高，但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍[10]。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。
CRISPR/Cas9技术以自己操作的便捷性，高效的基因编辑能力获得青睐，成为当下科研工作者的新宠儿。各大实验室纷纷加入开发CARISPR/Cas9技术的行列中，媒体也将之评为21世纪最有影响的十大技术之一。让我们跟随CRISPR/Cas9技术的脚步一起加强科研基础的建设，推动生物科研的进步！
详细信息你可以参考：http://www.bbctg.com.cn/show_2/1733.html
8. crispr-cas怎么导致基因改变
4月15日，隶属于麻省理工学院和哈佛大学的世界著名生物医学研究机构Broad研究所宣布，美国专利局批准了由他们所申请的基于CRISPR-Cas9系统的基因编辑技术专利。这是目前世界第一例获得专利保护的基于CRISPR-Cas9系统的基因编辑技术。
正在生物体内发挥功能的CRISPR-Cas9系统。插画家：Stephen Dixon
所谓基因编辑技术，是指对DNA核苷酸序列进行删除和插入等操作，换句话说，基因编辑技术使得人们可以依靠自己的意愿改写DNA这本由脱氧核苷酸写而成的生命之书。然而长期以来，对DNA的编辑只能通过物理和化学诱变、同源重组等方式来对DNA进行编辑。然而这些方法要么编辑位置随机，要么需要花费大量人力物力进行操作。因此，能够方便而精确的对DNA和核苷酸序列进行编辑，是科研工作者们长期以来的梦想。CRISPR-Cas9系统的诞生和成熟标志这这一梦想逐渐变为现实。此外不仅仅在科研界，在诸如医疗、农业、畜牧业等研究中，这一技术也显现除了巨大的应用前景。因此，这一技术获得专利，是该技术走向应用的里程碑式事件。
从细菌免疫系统到DNA编辑工具
CRISPR-Cas9系统并非天生就是为人类使用而产生的。它的本质其实是细菌中一种对付诸如病毒等外来DNA的防御系统。在一些细菌基因组中存在一系列成簇排列的DNA序列，被称作“规律间隔成簇短回文重复序列”（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）。这些重复序列的间隔序列，被发现和很多能够侵入细菌的噬菌体DNA序列相同。进一步研究发现，这些序列在被转录成为RNA后，能够和细菌产生的一类称为Cas的蛋白质形成复合体，来对Cas蛋白起到导向作用，因此这段RNA也被称为导向RNA（guide RNA，gRNA）。当复合体检测到入侵的DNA和gRNA序列一致时，Cas蛋白就能够切割入侵的DNA，达到防御的目的。
注：严格来说，在细菌体内gRNA由两部分组成：一部分为活化Cas蛋白所需的tracrRNA，另一部分为来自于间隔区、识别入侵DNA的crRNA。在人工构建的CRISPR-Cas9系统载体中，这两段RNA可融合为一条。
CRISPR-Cas系统这种序列特异性的DNA切割机制很快引起了人们的兴趣。由于这一系统能够切割DNA，并且其序列特异性由crRNA的序列所决定，因此它成为了DNA编辑的理想工具。细菌中的CRISPR-Cas系统极为多样，而一个来自产脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的由Cas9蛋白参与的系统被人们研究的最为透彻。因此人们对它进行了改造，将编码Cas9蛋白的序列及其附属元件共同制造成为一个单一的载体。同时为了能够让这些组分进入真核细胞的细胞核，还加入了入核信号元件。这样一来，只要科研人员只需针对需要编辑的DNA序列合成一段DNA序列，插入这个载体的特定部位。在转入宿主细胞后，产生的人工构建的gRNA就能指导Cas9蛋白切割宿主细胞特定的DNA序列，从而起到基因编辑的作用。
CRISPR-Cas9基因编辑系统示意。图片来源：《生物化学与生物物理进展》
DNA编辑的广泛前景
CRISPR-Cas9系统，被称为第三代基因编辑技术。相比于它的两位前辈ZFN系统和TALEN系统，它有着一些无可比拟的优点。首先，CRISPR-Cas9系统的可用位置更多。理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可以用CRISPR-Cas9进行编辑的位置，可以说这一技术能对任一基因进行操作，而TALEN和ZFN系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个可用位点，这大大限制了使用范围。其次，CRISPR-Cas9系统更具有可拓展性，例如可以通过对Cas9蛋白的修饰，让它不切断DNA双链，而只是切开单链，这样可以大大降低切开双链后带来的非同源末端连接造成的染色体变异风险。此外还可以将Cas9蛋白连接其他功能蛋白，来在特定DNA序列上研究这些蛋白对细胞的影响。第三，更为重要的是，CRISPR-Cas9系统的使用极为方便，只需要简单的几步就能完成，几乎任何实验室都可以开展工作，而不需要向ZFN和TALEN那样借助商业公司的协助完成。由于以上特点，CRISPR-Cas9被评为2013年生物学10大突破之一。值得说明的是，CRISPR-Cas9系统在真核细胞中很多重要的研究，都是由华人学者张峰主持完成的。
由于来源于细菌的CRISPR-Cas9系统在真核细胞内也能很好的工作，这显示出了其巨大的应用潜力。例如在基础科学研究领域，CRISPR-Cas9系统最多的是被用来定点敲除一些基因，从而便于研究这些基因的生物学功能。同时CRISPR-Cas9系统的商业化应用潜力也不容小视。例如在生物治疗领域，结合诱导多能干细胞（iPS）技术，人们可以将通过基因编辑修复的iPS细胞重新发育为正常组织和器官来供病人使用。而在家畜育种等工作中，对一些关键性状基因的编辑能够大大加快良种的育种速度。
正是由于CRISPR-Cas9的诸多优秀特点和广泛的应用前景，因此它成为了专利申请的热门方面。尽管已经有多份应用CRISPR序列或Cas蛋白的技术专利，但这次Broad研究所获得批准的是第一份将一整套CRISPR-Cas9系统载体和操作方法包括在内的专利。这意味着今后使用这一技术进行基因编辑操作都将涉及这份专利所保护的内容。那么，专利的批准是否会妨碍这一技术的使用呢？目前来看，基础研究受到影响的可能性不大，因为Broad研究院的主任埃里克·兰德（Eric Lander）在专利宣布的新闻稿中表示：“考虑到Broad研究所的使命是为了加速我们对于疾病的理解和治疗，因此我们承诺授权给全球的研究团队使用这种技术的权利。”但是，在更有利可图的商业化应用领域，这一专利的出现是否会对使用该技术的企业造成影响还有待观察，毕竟Broad研究所在上述表态之外还有一句：“享有这一专利的限制权”