什么是激光显微切割

㈠ 激光显微细胞分离技术原理和流程

在基础医学研究中涉及越来越多的如某一疾病状态组织中，多种基因或遗传变化，区别发展中的组织细胞群以及疾病状态组织细胞，将有助于了解疾病发生的分子机制。因此，在下一代的分子分析方法将需要进入微观世界及自动化程度高。对
某一特殊个体的切片进行遗传指纹图谱鉴定，将有助于诊断及指导治疗。

然而，即使是最经典、可靠的检测方法，也不可避免混杂多种状态细胞中DNA、RNA或蛋白质分子的干扰，因此，需要发展组织显微分离技术，以解决从混合细胞型组织中分离某单一群的细胞。最开始，研究者从冰冻的组织块中粗略地挖取富含某一类细胞类群的组织，或用激光破坏手工墨水标记的不需要部分，或手工工具针或刀机械地去除或刮取相应的组织。上述几种方法在操作过程中繁琐，不够精确，效率不能适应常规的临床分子诊断方法。为了解决上述问题，美国国立健康研究院肿瘤研究所病理研究室与生物医学设备组合作研发激光俘获显微切割技术，发展为Acturus 的PixCell II系统。在操作这套系统时，首先在组织切片上覆盖一层透明的膜，在显微镜下观察该组织切片，选择某一特殊细胞后，开启脉冲式红外激光束，使膜融化变得粘性很强(该膜的成份为 Ethylene Vinyl Acetate Polymer)，等到冷却后将该位置的细胞牢固地粘附在上面从而分离细胞。

该种方法较以往方法改进之处：首先，它简单，不需要移动任何切片部位，一步即可完成从组织中分离特殊细胞，这些在膜上的细胞依然保持其原有的形态，使用无菌、一次性的膜可最大限度地避免可能的污染。这对于后续进行PCR检测是尤为重要的。其次，使膜活化所需的激光能量很小(<50mW)，与常规显微配合是充足的，完全能够满足临床病理组织细胞显微分离的需要。再者，LCM技术分离细胞速度较以往方法有很大提高，例如，从肾组织切片中分离一个肾小球(Glomerulus)所需时间小于10秒，一小时内即可轻松地分离上百个肾小球。手工分离方法远远不能达到该速度。由于组织切片固定，操作者可以反过来确定所分离的细胞是正确的靶细胞。而手工机械显微分离可能会引起周围其它细胞一块松动，污染靶细胞。

一个新技术及伴随新技术诞生的仪器会对科学研究产生重要的影响。在NATURE MEDICINE • VOLUME 5 • NUMBER 1:117-112 • JANUARY 1999 的研究论文中，作者将 LCM、 RNA扩增和基因芯片三种技术整合到分子神经生物学研究中.研究涉及一个神经组织：背根神经节(DRG).DRG位于脊髓两边,很小,大鼠的DRG只有1/3大米粒大.脑内和DRG有类似功能的组织是三叉神经节.DRG中有两类神经元:大神经元和小神经元.

国内科学家曾利用DD-PCR技术研究正常大鼠和接受伤害性刺激的大鼠的DRG的基因表达差异，筛选参与伤害性刺激相关基因,包括新基因和已知基因的新功能.目前认为DRG中与伤害性刺激有关的神经元是小神经元.研究者可能的苦恼是不能分别取出DRG中的大小神经元来进行研究。另一个苦恼是由于DRG很小, 所以为了提取足够使用的RNA,不得不杀大量大鼠,有时一次就杀上百只。而且从大鼠取DRG也不是一件很容易的解剖技术.还有一个苦恼就是DD-PCR要接触同位素,即在进行DD-PCR反应时加入同位素标记的dATP或dCTP，这样得到的PCR产物就标记上了同位素.产物进行PAGE,电泳后干胶仪器干胶.干胶曝X光片, 曝光后的X光片和胶对好位置,从胶中回收感兴趣的DNA片段。鉴于这些苦恼，研究者们可能希望:要是能把大小神经元分开该多好,要是能把RNA扩增该多好,要是做DD-PCR时能不用同位素该多好.如今看来,这些难题似乎可以迎刃而解了。即利用LCM技术取出感兴趣的细胞,利用Epicentre Ampliscribe T7 Transcription Kit把有限量组织中提出的有限量RNA扩增;进行DD-PCR反应时用红外荧光染料标记(的引物)技术取代同位素标记技术,经Odyssey Infrared Imaging System检测和定位,从而可以从胶中回收希望回收的片段。这个回收方案同样可以用于AFLP研究者回收他们感兴趣的DNA片段。

当前,在生命科学领域,和基因组学及蛋白组学一样热门的是神经科学,而且神经科学在国内外都正在成为最具挑战性和最具诱惑力的科学。因此,在国内外从事神经科学研究的科技工作者越来越多,国家对神经科学的资助也越来越大。神经系统由外周神经系统和中枢神经系统组成,中枢神经系统包括脑和脊髓.神经系统主要由两类细胞组成：神经元和胶质细胞.在脑内,不同解剖区域行使不同功能,这里所讲的解剖区域是指核团。核团在显微镜下才可以辨别,是相对集中在一个区域的可能行使一定功能的神经元和胶质细胞的集合体。把某个核团从脑内取出来是不太现实的。脑内核团数以百计,如果要想研究基因在脑内核团的表达水平, 在以前只能用原位杂交技术。如果要想研究蛋白质的表达水平或磷酸化等状态，只能用免疫组织化学技术。而这两个技术虽然能精确定位基因或蛋白质在脑内核团的表达情况,缺点是通量小。因此，如果研究者主要是为了研究很多种基因在特定核团的神经元或胶质细胞的表达情况,新的解决方案之一就是组合LCM技术、RNA扩增技术和基因芯片技术。即利用LCM技术将特定核团的神经元或胶质细胞取出,提取总RNA或mRNA,RNA反转录为cDNA并进行扩增.最后将cDNA标记为探针,和基因芯片杂交。如果研究的基因种类数不多,那么也可以只提取LCM获得的细胞的总RNA,利用定量RT-PCR技术来进行基因表达分析。

㈡ 有谁知道广州哪些大学可以做激光捕获显微切割

中山医附一院

㈢ 什么是激光显微切割技术

显微切割（micro-desection）就是在显微镜下用手工或仪器采样的方法从组织切片或细胞涂片上将所要研究的形态或表型相同的细胞从组织三维构造中分离出来，获得纯的细胞群（pure cell population），以备进一步作分子水平的研究。显微切割技术的贡献就是克服了组织的细胞成分非常繁杂这一重大的缺点。
一、显微切割的方法
1．材料来源
微切割可用于福尔马林固定石蜡包埋的组织切片、冰冻切片、培养细胞和细胞涂片。但所用载玻片不准涂抹任何粘附剂，常用的组织切片是HE染色的常规石蜡切片（厚5μm）。
2．切割及细胞采集方法
微切割及细胞采集方法大体上可分为手工操作和仪器操作两大类。两者各有长短。从两个方面评价这些方法，一是准确性，即有无杂细胞污染；二是它的效率，能否在较短时间内采集到足够的细胞；当然也要考虑方法所需费用。
（1）手工操作 就是用消毒的细针或刀片搔刮组织切片（厚5~15μm）上的细胞，并将其移至Eppendorf管中。
（2）仪器操作 利用激光进行微切割和细胞采集，其特点是微切割的精度高，可进行单个或几个至数十个细胞的切割，可获得很纯的细胞群体，并适用于各种组织材料；再就是效率高，但仪器价格昂贵。具体又有4种不同的方法：①激光微光束微切割 ② 激光加压弹射 ③贴于膜上的原组织微切割 ④激光俘获微切割。
二、显微切割的应用
1．细胞基因突变及微卫星变异的研究
2．细胞基因拷贝数的变化和甲基化水平的检测
3．定量RT-PCR
4．比较基因组杂交
5．cDNA微阵列（芯片）
资料来源于西安测维光电，西安测维光电技术有限公司是一家专业生产及销售精密光学显微镜的，公司主要产品：体视显微镜、生物显微镜、金相显微镜、金相分析软件、偏光显微镜、荧光显微镜、相衬显微镜、测量显微镜、工具显微镜、行业专用显微镜、光纤冷光源、平行光管、折射仪等光学仪器。

㈣ 激光捕获显微切割 获得的单细胞可以用来测序吗

首先你需要一台抄能够真正获取到单细胞的激光显微切割系统。该系统必须能够很好的获得单细胞，同时不能破坏细胞活性。推荐德国的MMI
后期单细胞测序时，需要获取多个单细胞才具有实际意义。通常需要100-1000个左右的单细胞进行测序。
基因公司可以提供单细胞测序的所有技术支持。