色谱使用前采用什么仪器

㈠ 液相色谱仪的使用步骤

目的：制定规范的高效液相色谱仪操作、维护保养和清洁规程。
范围：适用于Agilent 1260 HPLC。
责任：色谱检验工程师负责本规程执行。
内容：
1 开机
1.1 打开电脑。
1.2 打开液相色谱各个模块的电源。
1.3 双击桌面“仪器—联机”，进入联机界面。
1.4 排气：
1.4.1 手动旋开泵处冲洗阀（逆时针旋转约1圈）。
1.4.2 右键单击“泵”图标区域，选择“方法…”选项，进入泵编辑画面，设流速：5ml/min（一般为3－5ml/min），点击“确定”。
1.4.3 右键单击“泵” 图标，点击“控制…”选项，选中“ON”，点击“确定”，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止，（一般为5分钟），切换通道继续冲洗，直到所有要用通道无气泡为止。
1.4.4 右键单击“泵” 图标，点击“方法…”选项，设流速：0ml/min，手动旋紧冲洗阀。
1.4.5 右键单击“泵”图标，点击“方法…”选项，按照方法要求选择合适比例的流动相，设流速：1.0ml/min。
1.4.6 同理右键单击“柱温箱”，“检测器”图标，点击“方法…”选项，按照方法的要求设置温度，波长，点击“控制” 选项，“ON”打开柱温箱和检测器。

2 编辑方法
2.1 点击“方法”－“编辑完整方法”开始编辑完整方法。
2.2 选中除“数据分析 ”外的三项，进入下一选项卡。
2.3 方法信息：在“方法注释”中加入方法的信息（如：This is for test!）。进入下一选项卡。
2.4 泵参数设定：在“流速”处输入流量, 如1.0ml/min，停止时间：如10 min（该停止时间仅为做一个样品需要的时间），按照要求选择合适比例的流动相配比，如乙腈：水＝75：25，A为水，B为乙腈，则设置B：75％即可。进入下一选项卡。
2.5 自动进样器参数设定: 选择“洗针进样”----可以输入进样体积和洗瓶位置，进入下一选项卡。
2.6 柱温箱参数设定: 在“温度”下面的空白方框内输入所需温度,如：40度。进入下一选项卡。
2.7 UV检测器参数设定: 在“波长”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm。点击确定。
2.8 在“ 运行时选项表 ”中，选中“ 数据采集”，点击“确定”。
2.9 从“方法”菜单，选中“方法另存为…”，输入一方法名，如“测试”，点击“确定。

3 单次采集
3.1 从“运行控制”菜单中，选择“样品信息”选项，选择合适的路径，在“数据文件”中选择 “前缀/计数器”，输入样品瓶的位置，点击“确定”。
3.2 基线平稳后约10分钟，从“运行控制”菜单中选择“运行方法”。

4 多次数据采集
4.1 按照步骤2 编辑完整方法。
4.2 点击“序列”－“序列表”，输入“样品瓶”“样品名称”，“进样次数”，选择合适的“做样方法”
4.3 点击“序列”－“序列参数”，选择序列数据的保存路径（序列会自动生成以“序列名称－时间”为名称的文件夹保存数据），数据建议以选择 “前缀/计数器”保存。
4.4 从“序列”菜单，选中“序列另存为…”，输入一序列名，如“测试”，点击“确定。
4.5 从“运行控制”菜单中选择“运行序列”。

5 数据分析（脱机状态使用）
5.1 双击“仪器 —脱机”图标 进入的脱机画面。
5.2 从“视图”菜单中，点击“数据分析”进入数据分析画面。
5.3 从“文件”菜单选择“调用信号”，选中您的数据文件名。点击“ 确定”，则数据被调出。（如预建立标准曲线，应先打开浓度较低的标样图谱。）
5.4 做谱图优化：从“图形”菜单中选择“信号选项”。从“范围” 中选择“满量程” 或“自动量程” 及合适的时间范围或选择“自定义量程” 调整。反复进行，直到图的比例合适为止。点击“ 确定”。

6 积分:
6.1 从“积分”菜单中选择“积分事件”选项，选择合适的“斜率灵敏度”，“峰宽”，“最小峰面积”，“最小峰高”。点击 ，自动加载积分参数。
6.2 点击左边“√”图标，将积分参数存入方法并退出“积分事件”。
6.3 如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。

7 标准曲线
7.1 点击“校正”－“校正设置”，输入“含量单位”。
7.2 点击“校正”－“新建校正表”，点击确定。输入“化合物名称”和“含量”，点击“确定”，按照提示删除其他组分。
7.3 至此完成单级校正，如要增加校正级别，应从“文件”菜单选择“调用信号”，选中您的数据文件名（第二个标样），点击“校正”－“添加级别”，点击确定，输入“含量”，依次增加校正级别。

8 打印报告
8.1 从“报告”菜单中选择“设定报告”选项，点击“定量结果”框中“定量”右侧的黑三角，选中“外标法”，其它选项不变，点击“ 确定”。
8.2 从“报告”菜单中选择“打印报告”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则点击“报告” 底部的“打印”钮。
8.3 点击“文件”－“另存为”－“方法”，把数据分析方法保存，下次分析可直接在“文件”－“调用”－“方法”下，将该方法调出使用。（调用的方法中含有积分方法，标准曲线方法和打印报告方法）

9 关机
9.1 关机前，先关紫外灯，用相应的溶剂（甲醇或乙腈）充分冲洗系统大约30分钟。（色谱柱最终应保存在甲醇或乙腈中）
9.2 退出化学工作站，依提示关泵，及其它窗口，关闭计算机。
9.3 关闭Agilent 1260各模块电源开关。

10 其它注意事项
10.1 当样品运行时，切勿打开自动进样器前遮盖，否则进样过程停止。
10.2 系统发生漏液时，机器会检测到并停止进样，状态指示灯为红色。检查擦干并安置好漏液处，擦干漏液传感器，单击ON按钮，系统重新初始化。
10.3 注意紫外灯使用寿命，切勿来回开关紫外灯。

㈡ 常用的色谱仪器有哪两大类，各自有何特点

色谱仪器分为气相色谱和液相色谱，还有气相色谱质谱联用仪等；

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那么，高效液相色谱仪（HPLC,）如何选型？

高效液相色谱仪的选型，归结起来就是2个问题：如何确定高效液相色谱仪的配置？如何选择高效液相色谱仪的品牌？

今天我们就来谈谈第一问题，如何确定高效液相色谱仪的配置？

高效液相色谱仪可以分为5大部分：高压输液泵单元、进样器单元、分离单元、检测器单元、色谱数据处理单元，下面我们来逐一分析，谈谈高效液相色谱仪的选型细则。

1、高压输液泵单元的配置选型：

高效液相色谱仪的高压输液方式分为等度方式、梯度方式两大类别。

等度方式：在色谱分析过程中，流动相中各个组分的比例不随时间发生变化，例如某次分析过程中流动相中甲醇与水的比例是50：50一直保持不变，那么这种就叫做等度方式。

梯度方式：在色谱分析过程中，流动相中各个组分的比例随时间发生发生变化，例如某次分析过程中，随着时间的推移，流动相中其中一种（或几种）溶剂比例逐渐增大、另一种或几种溶剂的比例逐渐减少，最终那么这种输液方式就叫做梯度方式。

相应以上2种流动相输液方式，有等度泵和梯度泵这两种配置方式。

等度泵：一般采用单泵来作为高压输液泵单元，这是一种最简单最经济的配置方式。

梯度泵：又分为高压梯度、低压梯度。

高压梯度：常用的是二元高压梯度泵，也有三元高压梯度泵；我们通常所说的双泵，就是指“二元高压梯度泵”。有几元高压，则必须有几台泵；高压梯度泵单元，除了几台高压泵之外，还需要有配套的流动相混合装置（通常采用混合器）；由于是高压混合的梯度方式，所以通常不太会产生气泡，脱气机通常可以不用配备。

低压梯度：与高压梯度“有几元高压就用几台泵”所不同的是，低压梯度只需要一台高压泵，但是在高压泵的前端，需要加上比例阀（有的公司称为低压梯度单元），通过比例阀来调节几种不同流动相进入高压泵的比例，从而实现梯度淋洗。因为低压下各种不同溶剂混合时可能产生吸热或放热，所以对于低压梯度泵单元来说，流动相脱气机与混合器一样，都是必不可少的。

高效液相色谱仪（HPLC）的高压输液泵单元的选型，主要是根据所检测项目方法的所需来定，方法中流动相输液是等度方式，那么等度泵（单泵）即可满足需求；如果方法中规定需要用到梯度淋洗输液方式，那么就需要选择梯度泵了。

在一些有HPLC分析方法开发任务的单位，为了满足将来可能的方法开发需要，即便暂时不需要梯度泵，也往往会配备梯度泵以利拓展方法。

2、进样器单元的配置选型

高效液相色谱仪（HPLC）的进样器单元，有2种配置可供选择：手动进样器、自动进样器。

手动进样器：无论是国产还是进口大牌，例如沃特世（Waters）、岛津（Shimadzu）、安捷伦（Agilent），世界上绝大多数公司均采用美国Rheodyne公司生产的六通进样阀作为高效液相色谱仪的手动进样阀。

自动进样器：自动进样器的最大优点就是，能极大的提高设备使用效率、减少人力成本。例如一个公司的HPLC使用部门，可以在下午下班之前，把未做完的50个样品都放进自动进样器内，然后设定分析程序、仪器清洗程序、关机程序，然后所有的人都可以下班，无需派人值守，第二天早上打印图谱、上报数据即可。

3、分离单元（高效液相色谱柱）

色谱柱是高效液相色谱仪的核心部件。

色谱法最核心的机制就是把样品中各个组分进行有效分离，而实现分离靠的就是色谱柱。

色谱柱选择时需要考虑四大参数：固定相类型（填料种类）、柱长、柱内径、填料粒度。

固定相类型：目前主要有硅胶基质的ODS(碳十八)、氨基、氰基、苯基、硅胶等色谱柱，以及高分子聚合物的固定相填料。目前ODS(碳十八)应用最为广泛，高效液相色谱法大约有80%分离采用的就是ODS(碳十八)填料。

柱长：色谱柱的长度越长，分离效果越好，但是背压也就越大、柱子价格就会越贵。目前柱长应用较多的是375px、500px、625px这三个长度，尤其以625px最多。

柱内径：其它几个柱参数不变的情况下，高效液相色谱柱的内径越小，分离度越好（分离度越高），但是柱负载量越小。常用柱内径是3.9mm、4.6mm、6.0mm，尤其以4.6mm为最常用。

填料粒径：根据色谱法的速率理论，填料粒径越小，分离效果越好；但是填料粒度越小，在同样的流动相输送流速下，对于高效色谱仪高压泵的背压也就越大，对于高压泵的加压能力、密封性能也就要求越高。高效液相色谱仪一般采用3微米、5微米或10微米的填料粒径，而3微米以下粒径的填料，通常应用于超高效液相色谱仪。高效液相色谱法应用最多的是5微米粒径的填料。

分离单元还有另外两个问题需要掂量：是否需要配预柱（保护柱）、是否需要配柱温箱。

预柱（保护柱）：预柱（保护柱）的存在，会加大色谱死体积，会降低柱效，所以除非样品特别脏、或有特别多的高分子物质会堵塞分析柱，否则尽量不用预柱（保护柱）。

柱温箱：因为高效液相色谱法对于温度的些微波动并不特别敏感，除了一些对于柱温稳定性要求特别高的分离，高效液相色谱法很多情况下并不需要配置柱温箱。当然，如果采购预算足够多，安装柱温箱确实能有更好的色谱出峰时间重复性。

4、检测器单元的配置选型

高效液相色谱仪的检测器有很多种，最常见的是紫外检测器，还有示差检测器、荧光检测器、二极管阵列检测器、蒸发光散射检测器等等。

紫外检测器：是一种选择性检测器，几乎是所有HPLC检测器里面价格最便宜、应用最广泛的一种检测器，适合于测定有紫外吸收的物质（带苯环、杂环、双键叁键的物质）。紫外检测器的特点是灵敏度很高、适用性很广泛。

示差检测器：是一种通用型检测器，但是它的灵敏度低于紫外检测器，而且它对于流速比较敏感。示差检测器主要用来对一些没有紫外吸收的物质进行检测，例如糖类、高分子聚合物等等。

荧光检测器：仅仅适合于在紫外光照射下能发射荧光的物质，例如维生素A、维生素D、黄曲霉毒素等检测。高效液相色谱仪的荧光检测器的特点是灵敏度高、但适用范围较窄。

二极管阵列检测器：是紫外检测器的一个变种，二极管阵列检测器的特点是灵敏度较紫外检测器低、但是能做三维图谱，特别适合于医药研发类的应用。

蒸发光散射检测器：蒸发光散射检测器是一种新型的通用型检测器，未来的趋势是可以替代示差检测器等来检测无紫外吸收的物质，但是目前价格非常昂贵。

5、色谱数据处理单元

高效液相色谱仪的色谱数据处理单元，有数据处理机和色谱工作站两种，随着电脑的普及与应用，色谱数据处理机已经渐渐被淘汰，目前以色谱工作站为主流。

色谱工作站又分为可否反控两大类。

可反控工作站：不但能记录与处理色谱数据，而且可以反控高效液相色谱仪的各个组成单元。因为一些控制指令接口与数据传输的技术性问题，可反控工作站一般是各大仪器厂商自行研发与设计的，互相之间不能通用。

不可反控工作站：仅能记录与处理色谱数据，不可反控高效液相色谱仪。不可反控工作站通常是外挂式的，包含硬件和软件两大部分，硬件部分主要是一个A/D转换器，将高效液相色谱仪传输来的模拟信号转换成数字信号，再输进计算机；软件部分主要功能就是把硬件传输来的数字信号转换成图谱并进行积分计算等操作。

不可反控工作站的优点是通用性强，但是不可反控仪器、不便进行自动化操作。

二极管阵列检测器必须要用特殊的三维色谱软件。

综上所述，搞清楚了高效液相色谱仪的高压输液泵单元、进样器单元、分离单元、检测器单元、色谱数据处理单元的选型考量细则，那么我们才可以在尽量节约经费的情况下，选到我们所需要的仪器配置了。

㈢ 同一根色谱柱，在不同的色谱仪器上，采用相同的色谱条件，但是杂质的分离度差异太大，比如A和B两种物质

如果其他条件完全相同，也就是你所说的死体积的问题。管路上都差不多，主要是回检测池的问题。如果仪器答1检测池较小，进样量比较小的话，会有你说的完全分离的情况。而换成了仪器2，检测池较大，会出现样品分散的情况，导致分不开。

㈣ 采用色谱法原理的分析仪器有哪些

高效液相色谱，气相色谱，凝胶渗透色谱，气质联用，液质联用等

㈤ 液相色谱仪使用步骤

高效液相色谱仪的使用

1.色谱柱它包括空柱和填料。空柱是内壁抛光的不锈钢管，内径为4～5mm，长100～250mm。按气相色谱法中洗涤空柱的方法洗净，用匀浆法填充固定相。将此柱装入仪器的管路中，用柱式机械往复泵输入新鲜脱气的流动相。等基线平直后可用苯、萘、菲的混合试液，用正己烷(含 0.05%甲醇)或甲醇：水(83：17)为流动相测定柱效及分离度塔板数在2～3万/ml以上及分离度在1.5以上者，柱效好。为防止柱污染，常用1个 50mm长，4~5mm内径，装有硅胶(40-50mm)或立柱相同填料的保护柱(预柱)接在主柱之前，以延长色谱柱的寿命。反相键合相柱用毕。必须用水充分流经，以洗去盐类、酸碱等杂质防止柱生锈及填料中杂质的积聚，再用甲醇流经洗涤使色谱柱获得再生。

2.流动相的洗脱方式配好经脱气的流动相放于贮液瓶中，经过有滤过头、内径2mm的聚四氟乙烯管流入高压泵进入色谱柱，最后自检测器流出或收集或作废液回收。用流动相洗脱的方式有恒溶剂脱洗法(isocratic dlution)，即自洗脱开始到结束，溶剂的配比恒定。另一类为梯度洗脱法(gradicnt clution),即使溶剂的极性强度在色谱过程中逐渐增加。须按一定程序不断改变流动相的浓度配比，从而使同一个试样中组分性质相差较小的及较大的都能在一次色谱过程中很好分离，而整个色谱过程缩短。必须注意，梯度洗脱法不能用于分子排阻色谱及用电化学检测的反相高效液相色谱法中。

3.检测器适用于血药浓度的检测器有紫外线吸收，荧光发射和电化学三种。紫外检测器应用于对紫外光有吸收的药物，大多数药物分子对紫外光有吸收，故能较普遍采用，检测限有0.1μg左右。紫外检测器有固定波长型、可变波长型及扫描器，既能使流动相停流作组分的定性定量检测，又能提高测定灵敏度，重现性较好。荧光发射检测器对能产生荧光的药物才能使用。80年代应用激光替代氙灯光源，光强度增加了3~4倍，对某些药物的检测限可达pg级。电化学检测器是由一个碳糊或破碳做成的蒲层电解池。常用于检测儿茶酚胺类及有酚类基团的各种药物和代谢物。流出组分进入2μl的薄层电解池，在一暄电压下电解产生电流，放大后检测，检测限pg级。

4.数据处理现代高效液相色谱仪带有数据处理系统，除记录谱外，还能自动记录峰的保留时间，能自动积分求算峰面积，并能按照预定的程序作有关计算，报告分析结果。

高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法

1 液相色谱仪系统

液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱、柱温箱、检测器、数据处理系统组成(如图1所示)。对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件，同时也是容易出事故的主要场所。

2 常见问题及解决方法

2.1 针对柱压问题(表1)

柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值，而是指压力波动范围在50PSI之间。压力过高、过低及波动较大都属于柱压问题，但柱压的高低与色谱柱的种类、品牌、液相系统本身及使用的流动相种类相联系。值得注意的是在使用梯度洗脱时，进柱压的平稳缓慢的变化是允许的。

在实际应用中柱压过高可从以下几个方面来考虑[1]。首先考虑柱子是否被堵，此时可更换一根新柱子进行检测。

2.2 针对保留时间漂移的问题 [2，3] (表2)

保留时间的改变是很多液相色谱使用者常碰到的问题，其包括了保留时间增大和减小。它的产生与很多原因有关。

2.3 针对异常色谱峰问题[2-4]

异常的色谱峰指的是色谱图中无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。具体情况与原因分析如表3。

3 高效液相色谱仪的保养[5-7]

3.1 HPLC的日常操作条件

工作温度10～30℃; 相对湿度<80%; 最好是恒温、恒湿，远离高电干扰、高振动设备。

3.2 泵的保养

使用流动相尽量要清洁;进液处的沙芯过滤头要经常清洗;流动相交换时要防止沉淀;避免泵内堵塞或有气泡。

3.3 进样器的保养

每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。

3.4 柱的保养

柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动;当柱子和色谱仪连接时，阀件或管路一定要清洗干净;要注意流动相的脱气; 避免使用高粘度的溶剂作为流动相;进样样品要提纯;严格控制进样量;每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品;每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱;若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。

3.5 检测器(UV)的保养

紫外灯的保养要在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器;在分析完成后，马上关闭检测器。同时样品池要保养。

4 结语

在高效液相色谱使用过程中故障排出时要遵守以下原则：一次只改变一个因素，从而确定假定因素与问题之间的联系;如果通过更换组件来排查故障时要注意将拆下的完好组件装回原位，从而避免浪费;养成良好的记录习惯，一个良好的记录是成功地进行故障排除的关键。

总之，在使用高效液相色谱时一定要注意样品的前处理与仪器的正确操作和保养，仪器系统的干净是用好仪器和维护维修仪器的关键。

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㈥ 液相色谱仪使用及工作原理。

液相色谱仪是利用混合物在液-固或不互溶的两种液体之间分配比的差异，对混专合物进行先分离，而后分属析鉴定的仪器。广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。

液相色谱仪工作原理：统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中液相色谱仪的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。

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